低氧处理对不同年龄段C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

发布时间：2017-05-02 09:03

  本文关键词：低氧处理对不同年龄段C57小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于胚胎早期中胚层和外胚层的多能干细胞,在体内广泛分布。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有支持造血、自我更新、多向分化、免疫调节、分泌因子等诸多功能,在组织再生、创伤修复和多种疾病的治疗中有巨大潜力。然而由于BMSCs是一群不均一的细胞群体,其不同亚群的细胞表面抗原存在着差异。因此目前BMSCs表面标志物的筛选尚存争议。BMSCs具有较强的自我更新能力。BMSCs的生长曲线呈S形,在传代7代之前具有较好的生长特性。BMSCs具有多向分化能力。在不同的诱导条件下,BMSCs可分化为多种造血以外的组织细胞,如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、星形神经胶质细胞等。此外,BMSCs还发挥着支持造血、调节免疫、分泌某些因子的作用。如转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基质金属蛋白酶-9 (matrix metalloprotein-9, MMP-9)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等。除了以上这些优良特性,BMSCs还易于提取,易于体外扩增,易于外源性基因的导入和表达。因此BMSCs有望成为细胞治疗和基因治疗的有力工具。在多种造血以外的缺陷性疾病、退行性疾病、遗传性疾病的治疗中发挥重要价值。目前,自体干细胞移植是BMSCs应用于临床的重要手段,它有如下一些优势：一、细胞源于每个病人自身,供体来源充足；二、无免疫排斥反应；三、治疗费用相对低廉；四、无伦理学障碍。支持造血是体内BMSCs的主要生理作用之一。有报道称自体BMSCs和外周血造血干细胞共移植可用于治疗恶性血液病。大量报道证实自体BMSCs移植在骨、软骨、关节等创伤修复中的良好表现：自体BMSCs与同种异体骨支架复合可治疗犬下颌骨节段性缺损；自体BMSCs与藻酸盐载体复合可治疗兔关节软骨缺损；自体BMSCs与生物蛋白胶混合注射有利于兔前交叉韧带重建的术后恢复；自体BMSCs经旋骨内动脉灌注可用于治疗股骨头缺血性坏死。一些研究发现自体BMSCs还可用于组织创伤或组织缺损的修复性治疗：自体BMSCs可用于治疗裸鼠皮肤创面；自体BMSCs可以帮助重建兔受损的眼表,减轻水肿,抑制血管生成；自体BMSCs可用于进行犬膀胱部分切除修补。此外,自体BMSCs在一些缺血缺氧性损伤的治疗中亦能发挥重要作用(尽管其作用机制尚未非常明确)：自体BMSCs局部注射可用于疗小型猪心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI);经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention, PCI)的同时行自体BMSCs冠脉灌注可以抑制AMI患者的左心室重构,改善心功能；自体BMSCs局部注射可以改善下肢缺血的血流灌注；自体BMSCs可改善糖尿病足的局部症状。自体BMSCs亦可用于神经系统的修复：自体BMSCs静脉注射可改善中枢神经系统损伤后神经功能障碍的症状；经静脉自体BMSCs移植可用于治疗脑梗死；自体BMSCs血肿腔内冲洗有助于脑出血的术后恢复；自体BMSCs可用于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的治疗；自体BMSCs可以用于周围神经损伤的修复；自体BMSCs联合外周神经移植术可用于治疗脊髓损伤。然而,由于功能性神经元不仅要具备典型神经元细胞的形态特征和特异性标记,还应该具备可兴奋性、形成突触联系的能力、产生突触电位的能力等。因此,BMSCs的神经方向诱导是否成功尚存在很大的争议。但是自体BMSCs在不同器官多种原因引起的功能障碍中也能够发挥治疗作用：自体BMSCs可用于治疗猪急性肝功能衰竭；自体BMSCs移植可促进肝硬化SD大鼠模型残余肝脏再生；自体BMSCs可以缓解异基因小型猪的肝移植急性排斥反应；自体BMSCs移植可用于治疗终末期肝病；自体BMSCs移植可以促进兔缺血再灌注损伤后肾脏功能的恢复和组织结构的修复；自体BMSCs移植可以在急性重症胰腺炎早期保护大鼠免受损害；自体BMSCs移植联合胰岛素或降糖药治疗能有效降低患者血糖,并改善患者诸多临床症状。自体BMSCs移植是充分发挥BMSCs强大的组织修复、免疫调节、支持造血等功能的有效手段。因此,有很多学者致力于将BMSCs应用于更广泛的治疗领域。然而自体BMSCs移植受供体年龄的影响很大,随着人类年龄的增长,BMSCs也随之发生着生理性老化。氧化应激理论认为,随着人类年龄的增长,机体抗氧化系统失衡。随着大量活性氧的释放和积累,细胞逐渐老化甚至凋亡,对应的就是器官的衰退甚至衰竭。BMSCs也难逃这样的规律。研究发现,胚胎BMSCs,增殖能力较强,体外培养时无接触性抑制,但是分泌功能较差。而在成体BMSCs中,0-20岁之间的BMSCs生物学特性最优。因此,是良好的BMSCs来源。有人认为氧化应激学说并不能完美地解释细胞老化现象,我们或许能够找到一种能改善老化个体BMSCs生物学特性的方法。低氧处理对BMSCs的作用是一个有趣的课题。它似乎给人们提供了一点希望。有人推测由于骨髓里的氧浓度低于其他组织,所以低氧环境更利于BMSCs的生长。一些实验证实：3%02的持续性低氧可促进人BMSCs的增殖；1%02的持续性低氧可促进人BMSCs增殖,促进集落形成,促进低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1α)的表达,促进基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌,抑制BMSCs的成骨分化。但是也有相反的结论：低氧可促进含血清培养基培养的BMSCs增殖,但是在无血清条件下则表现为抑制增殖；1%02浓度是非致死性条件,但是可短暂抑制大鼠BMSCs的增殖。因此,人们认为低氧处理对BMSCs的作用与氧浓度大小、作用持续时间、培养基中的血清浓度、物种等多种因素相关。目的：适度的低氧处理可能会促进BMSCs的增殖。我们计划在C57小鼠BMSCs上重复这种处理,并且将这种处理应用于增殖能力差的老化C57小鼠BMSCs上,以期促进其增殖。方法：我们参考Billups-rothenberg公司的MIC101型细胞低氧培养系统,并作了相应改进。自制了一套新型低氧培养装置。这种装置的设计原理是从普通培养箱中引入的含5% CO2的混合气体作为气体来源,在“活性铁—蛭石—活性炭原电池”消耗了其中的O2之后再供给BMSCs。和MIC101型细胞低氧培养系统相比,这种装置无需连接钢制气瓶,使用时灵活方便安全可靠。这种装置可以保证气体的充分交换,保证测氧仪检测结果的准确性。这种装置可以在降低O2浓度的同时,维持CO2浓度的稳定。根据The Jackson Laboratory提供的数据,C57小鼠出生后3-6周相当于人类的20-30岁,C57小鼠出生后18-24个月相当于人类的56-69岁。我们选取3-6周C57小鼠作为年轻组,选取18-24个月C57小鼠作为老龄组。全骨髓法获取3-6周年轻组C57小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过换液、传代等方法体外扩增至第6代。并且选取了其中部分细胞进行冻存。取第6代年轻组C57小鼠的BMSCs作常规培养,于显微镜下观察细胞形态及数目,绘制连续5天的细胞生长曲线,以证实年轻组C57小鼠的BMSCs的增殖能力较强。取第6代年轻组C57小鼠的BMSCs作成骨诱导和成脂诱导,以证实年轻组C57小鼠的BMSCs的仍然具有良好的多向分化能力,证实全骨髓法获取C57小鼠BMSCs的可行性。取第6代年轻组C57小鼠的BMSCs于5%02低氧下处理30min,继而常规孵育8h。然后用结晶紫染色,于显微镜下观察细胞形态及数目的变化。全骨髓法获取18-24个月老化C57小鼠骨髓贴壁细胞作原代培养。于显微镜下观察细胞形态及数目,绘制连续12天的细胞生长曲线。以证实随着年龄的增殖,BMSCs的增殖能力减弱。全骨髓法获取老化C57小鼠的BMSCs较为困难。取接种后72h的老化C57小鼠的骨髓贴壁细胞于5%02低氧下处理30min,继而常规培养24h,并用结晶紫染色,于显微镜下观察细胞形态及数目的变化。结果：3-6周年轻组C57小鼠BMSCs,可体外扩增至第6代,并且保持了多向分化能力。经5%02低氧下处理30min后,呈片状脱落。18-24个月老化C57小鼠的骨髓贴壁细胞增殖能力差,经12天的原代培养仅形成了一个集落。经5%O2低氧下处理30min,并继续培养24h后,贴壁细胞数量明显减少,且无新的集落形成。结论：利用全骨髓法可顺利地获取的年轻组C57小鼠的BMSCs。第6代年轻组C57小鼠BMSCs生长良好,并保持了多向分化能力。但低氧处理可损害年轻组的C57小鼠BMSCs的增殖。利用全骨髓法获取老化C57小鼠BMSCs较为困难,低氧处理可损害老化C57小鼠骨髓贴壁细胞的原代培养。
【关键词】：低氧处理 骨髓间充质干细胞 细胞增殖
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第1章 前言17-25
• 1.1 BMSCs的生物学特性17-18
• 1.2 自体BMSCs在实验室和临床上的广泛尝试18-23
• 1.3 细胞生理性老化对应用自体BMSCs进行移植的限制23-24
• 1.4 低氧处理对BMSCs的作用24-25
• 1.5 本实验的研究内容25
• 第2章 仪器与耗材25-27
• 2.1 实验所用仪器25-26
• 2.2 实验所用试剂26-27
• 2.3 常用试剂的配制27
• 2.3.1 油红“O”的配制27
• 2.3.2 0.1%茜素红的配制27
• 2.3.3 0.01%PBS缓冲液的配制27
• 2.3.4 DMEM的配制27
• 2.3.5 完全培养基的配制27
• 第3章 实验技术和实验方法27-44
• 3.1 实验动物的选择28
• 3.2 低氧装置的制作和使用28-33
• 3.2.1 低氧装置的制作28-30
• 3.2.2 低氧装置中各种气体组分的变化及其换算30-32
• 3.2.3 低氧装置的使用方法32-33
• 3.3 C57小鼠BMSCs的原代培养33-35
• 3.3.1 年轻组C57小鼠BMSCs的原代培养方法33-34
• 3.3.2 老龄组C57小鼠BMSCs的原代培养方法34-35
• 3.4 细胞的全量换液和半量换液35-36
• 3.4.1 细胞的全量换液35
• 3.4.2 细胞的半量换液35-36
• 3.5 年轻组C57小鼠BMSCs的传代36-38
• 3.5.1 年轻组C57小鼠BMSCs的普通传代法36-37
• 3.5.2 年轻组C57小鼠BMSCs的多次消化传代法37-38
• 3.6 年轻组C57小鼠BMSCs的冻存38-39
• 3.7 年轻组C57小鼠BMSCs的复苏39-40
• 3.8 各年龄组C57小鼠BMSCs的低氧处理方法40
• 3.8.1 年轻组C57小鼠BMSCs的低氧处理40
• 3.8.2 老龄组C57小鼠BMSCs的低氧处理40
• 3.9 各年龄组C57小鼠BMSCs的结晶紫染色40-41
• 3.10 年轻组C57小鼠BMSCs的诱导分化41-43
• 3.10.1 年轻组C57小鼠BMSCs的成骨诱导41-42
• 3.10.2 年轻组C57小鼠BMSCs的成脂诱导42-43
• 3.11 细胞计数和统计学分析43-44
• 第4章 结果44-49
• 4.1 年轻组C57小鼠BMSCs增殖能力强且具有成骨、成脂能力44-45
• 4.2 低氧处理对年轻组C57小鼠BMSCs的培养不利45-47
• 4.3 老龄组C57小鼠BMSCs的原代培养较为困难47-48
• 4.4 低氧处理对老龄组C57小鼠BMSCs的培养不利48-49
• 第5章 讨论49-50
• 第6章 结论50-51
• 参考文献51-57
• 攻读硕士学位期间的研究成果57-58
• 中英文符号对照说明表58-60
• 致谢60-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：340638