肺炎链球菌融合蛋白PsaA-PcpA疫苗的应用研究

发布时间：2017-05-02 22:03

  本文关键词：肺炎链球菌融合蛋白PsaA-PcpA疫苗的应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在全世界范围内特别是发展中国家,肺炎是引起儿童和老人高发病率和死亡率的疾病。根据WHO报道,每年约有160万人感染肺炎致死,其中70万至100万病例是儿童。肺炎链球菌是导致肺炎的主要病原体,同时它还能引发鼻窦炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等疾病。由于抗生滥用导致耐药菌株的出现,疫苗已成为防止肺炎链球菌感染的主要方式。目前,临床上被广泛使用肺炎疫苗均以多糖荚膜为疫苗组分,虽然临床效果明显,但其保护范围受限于血清型,同时因为组分复杂生产成本高,导致价格超过了第三世界国家的承受能力。由肺炎链球菌蛋白作为疫苗免疫原的疫苗策略有助于摆脱血清型的束缚,同时预期的生产成本也会降低,并且在机理上具有更好的免疫源性,因此成为了近几年肺炎链球菌疫苗的研发方向。多种肺炎链球菌蛋白联合使用作为疫苗组分被认为可以提升疫苗的效果。肺炎链球菌表面粘附素A暴露于肺炎链球菌表面,序列保守,免疫原性较好,研究表明抗Psa A抗体具有减少肺炎链球菌定殖的作用。肺炎链球菌胆碱结合蛋白A是一种序列保守的表面蛋白,已有研究推测Pcp A可能在肺炎链球菌的黏附过程中发挥作用而在定殖中并非必须。本文同时采用这两种蛋白作为免疫原,将Psa A的全长序列,Pcp A的N端功能区序列融合,构建为融合蛋白Psa A-Pcp A,小鼠免疫Psa A-Pcp A后,检测特异性抗体水平,同时对实验小鼠进行肺炎链球菌的攻毒。结果表明,Psa A-Pcp A融合蛋白免疫原性较好,能够有效地刺激机体产生免疫应答,血清抗体水平在105以上,在肺炎链球菌的攻毒实验中,能对小鼠产生很好的保护能力,保护效果稍好于市售23-价多糖疫苗。以上结果证明Psa A-Pcp A作为广谱肺炎蛋白疫苗的候选组分具有可行性。
【关键词】：肺炎链球菌黏附素 肺炎链球菌胆碱结合蛋白 融合蛋白 广谱肺炎链球菌蛋白疫苗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-17
• 第一节 肺炎及肺炎链球菌10-11
• 第二节 肺炎链球菌疫苗简史与现状11-13
• 第三节 PsaA蛋白简介13-14
• 第四节 PcpA蛋白简介14-15
• 第五节 论文设计15-17
• 第二章 PsaA-PcpA融合蛋白的制备17-33
• 第一节 材料与仪器17-20
• 1. 质粒与菌株17
• 2. 限制性内切酶及试剂盒17
• 3. 主要试剂17-18
• 4. 主要仪器18
• 5. 主要溶液的配制18-20
• 第二节 实验方法20-26
• 1. 目的基因与引物设计20-21
• 2. PCR21
• 3. 琼脂糖凝胶回收目的基因片段21-22
• 4. 目的基因连接至质粒载体22
• 5. 转化入原核菌株22-23
• 6. 碱裂解法小提质粒23-24
• 7. 限制性内切酶进行质粒的酶切24
• 8. 融合蛋白PsaA-PcpA的表达24-25
• 9. SDS-PAGE25
• 10. Western Blot25
• 11. 镍离子亲和层析纯化融合蛋白25-26
• 第三节 实验结果26-32
• 1. Overlap PCR制备PsaA-PcpA基因片段26-27
• 2. pET20b-PsaA-PcpA表达质粒的构建27-29
• 3. PsaA-PcpA融合蛋白的表达29-31
• 4. PsaA-PcpA融合蛋白的纯化31-32
• 第四节 小结32-33
• 第三章 PsaA-PcpA融合蛋白的保护性研究33-38
• 第一节 材料与动物33
• 1. 蛋白、菌株与动物33
• 2. 主要试剂33
• 第二节 实验方法33-35
• 1. PsaA-PcpA融合蛋白免疫原性检测33-34
• 2. PsaA-PcpA攻毒保护性实验34-35
• 第三节 实验结果35-37
• 1. PsaA-PcpA融合蛋白免疫原性测定35-36
• 2. PsaA-PcpA融合蛋白攻毒保护性实验36-37
• 第四节 小结37-38
• 本文结论38-40
• 参考文献40-42
• 致谢42

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