RACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制

发布时间：2017-05-04 11:15

  本文关键词：RACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:复杂的信号网络在细胞生长、衰老、死亡等多种生命活动中起着重要的调节作用,这些信号网络的形成是由具有一定特异性的相对少量的信号分子(即支架蛋白)来完成的。激活的蛋白激酶C受体1(RACK1,基因名Gnb2l1)就是这样的一种支架蛋白。RACK1分子量为36 kDa,含有7个WD40重复序列,与G蛋白β亚基具有高同源性,在信号传导过程中可以作为锚定蛋白和穿梭蛋白以参与信号的传导或活化。大量研究表明RACK1在肝细胞癌等肿瘤的恶性生长中有着重要促进作用。而且RACK1在肝组织中高水平表达,但其在肝脏中的病理生理作用还是未知的。自噬是一个高度保守的细胞固有的生命进程,这个过程中,细胞的一些多余的成分或衰老的器官被转运到溶酶体降解或者分解。以此作为机体重要的降解去路而存在。在肝脏中,自噬促进脂肪降解,有利于脂代谢稳态的维持。自噬的启动自噬的启动需要AMPK活化或mTOR活性受抑导致的ULK1活化,接着ULK1磷酸化Beclin1导致自噬起始复合体ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15形成,MAPK家族成员JNK对Bcl2的磷酸化促使Bcl2与Beclin1解离,也有利于自噬起始复合体形成。Class III PI3K VPS34(也称为PIK3C3)激酶活性在复合物形成后升高,催化磷脂酰肌醇(PI3P)生成,招募DFCP1形成Omega小体,进而ATG12-ATG5共价结合,促进膜延伸和闭合,诱导LC3B从胞浆型(LC3B I)转变为膜型(LC3B II)、促进自噬体的形成。但是自噬起始复合体的形成机制还不清楚。我们的研究发现,RACK1对自噬有促进性作用,并且参与自噬起始复合体的形成,RACK1缺失导致肝细胞脂肪堆积。这将为自噬的相关机制的研究和脂肪肝的治疗方面的探索提供一些依据。目的:在肝来源细胞中探索RACK1对自噬是否有影响;探讨RACK1预防肝细胞脂肪堆积的作用;分析RACK1影响自噬的分子机制。方法:以饥饿或mTOR抑制因子处理诱导自噬,以氯喹阻断溶酶体活性;在上述处ii理前后通过westernblot检测自噬相关指标lc3bii和atg12-atg5等的表达;透射电镜观察饥饿诱导自噬小体和脂肪滴的形成;nilered染色分析脂肪堆积;免疫荧光分析dfcp1opuncta的形成;激酶活性分析的方法检测vps34活性;免疫沉淀与银染、质谱鉴定相结合寻找rack1相互作用蛋白;利用免疫共沉淀的方法验证rack1和自噬起始复合体atg14l-beclin1-vps34-vps15之间的相互作用;利用gst-pulldown的方法检测体外翻译的自噬起始复合体成分和rack1的直接结合。结果:1)rack1促进自噬并抑制肝细胞中脂肪堆积在肝来源细胞系中敲低内源rack1的表达,自噬标志物lc3bii的本底水平和饥饿诱导的lc3bii生成显著降低。rack1敲低的情况下,mtor抑制因子和/或氯喹作用后的lc3bii水平也降低,说明lc3bii水平下降的原因是自噬减少而不是溶酶体活性过强。westernblot鉴定gnb2l1f/f;alb-cre(即gnb2l1?hep)小鼠表明,rack1在肝细胞中的表达缺失,但在其它组织中的表达与对照gnb2l1f/f小鼠无差异。gnb2l1?hep小鼠从生后4个月起肝脏变大、变黄;透射电镜下可见6周大gnb2l1?hep小鼠的肝细胞脂肪滴增多而糖原减少、线粒体数量增多但体积变小;饥饿48小时后,gnb2l1f/f小鼠肝细胞中出现较多自噬小体,而gnb2l1?hep小鼠的肝细胞无自噬小体,并且线粒体膨胀、脂肪滴数量和体积增大。nilered染色证实了脂肪的堆积。westernblot表明饥饿前后gnb2l1?hep小鼠肝组织lc3bii生成均减少,证实rack1的缺失导致自噬水平的降低。2)rack1参与自噬的早期进程lc3bii的生成依赖于atg12-atg5的共价结合,westernblot表明饥饿前后gnb2l1?hep小鼠肝组织atg12-atg5生成均减少,提示rack1影响更早期的分子事件。在rack1敲低的肝来源细胞及其对照细胞中表达gfp-dfcp1,发现rack1敲低导致dfcp1opuncta形成的减少;并且整体vps34激酶活性或atg14l相关的vps34激酶活性均在rack1敲低或敲除的情况下降低,表明rack1参与自噬的早期进程。3)rack1促进自噬起始复合体的形成为了进一步揭示rack1参与自噬的分子机制,我们在rack1敲低的人肝来源细胞中表达GFP标签的人源RACK1分子,由于GFP-RACK1也受RNA干扰作用的影响,表达量很低,可以作为内源RACK1分子发挥作用。免疫沉淀饥饿前后肝来源细胞中的“内源样”GFP-RACK1分子,经银染和质谱鉴定,发现了一个可能的RACK1结合蛋白VPS15,提示RACK1是自噬起始复合体的一个成分。免疫共沉淀证实了这一推测Gnb2l1?hep小鼠肝组织中,自噬起始复合体的形成显著减少,说明RACK1促进自噬起始复合体的形成。4)RACK1形成二聚体并直接结合ATG14L,Beclin1,和VPS15在肝来源的细胞中表达外源的Flag-RACK1和GFP-RACK1,anti-FLAG免疫沉淀物中可以同时检测到两种不同标签的RACK1的存在,并且在饥饿处理后1h时,FLAG-RACK1共结合的GFP-RACK1量升高最为明显。GST-RACK1分别和体外翻译的VPS15、VPS34、ATG14L、Beclin1进行GST-pull down分析,复合物中可以检测到VPS15、ATG14L、Beclin1的存在,表明RACK1直接与ATG14L,Beclin1和VPS15结合。5)RACK1不影响AMPK,Ulk1,JNK活化Western Blot表明饥饿前后Gnb2l1?hep小鼠肝组织P-JNK,P-AMPK,P-Ulk1无缺陷。结论:肝细胞中,RACK1能够稳定自噬早期复合物的形成和促进自噬启动,维持正常的自噬功能,从而维持细胞的稳态和抑制脂肪堆积。
【关键词】：RACK1 自噬 LC3B 自噬起始复合物 ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-16
• 第一章 在肝来源细胞中检测RACK1对自噬的影响16-24
• 第一节 在肝来源细胞系中探讨RACK1对自噬的影响16-21
• 1 材料和方法16-19
• 2 结果19-20
• 3 讨论20-21
• 第二节 肝来源细胞中RACK1对自噬流的影响21-23
• 1 材料与方法21
• 2 结果21-22
• 3 讨论22-23
• 本章小结23-24
• 第二章 在条件性敲除RACK1的小鼠肝脏组织中探讨RACK1对自噬影响24-34
• 第一节 条件性敲除RACK1的检测24-27
• 1 材料和方法24
• 2 结果24-26
• 3 讨论26-27
• 第二节 在小鼠肝组织中敲除RACK1对肝组织的影响27-32
• 1.材料与方法27-29
• 2 结果29-31
• 3 讨论31-32
• 本章小结32-34
• 第三章 RACK1对自噬影响的机制探讨34-59
• 第一节 RACK1是对自噬体复合物的影响的探讨34-38
• 1 材料和方法34
• 2 结果34-37
• 3 讨论37-38
• 第二节 RACK1对自噬起始复合体PI3KC3的活性分析38-41
• 1 材料和方法38-39
• 2 结果39-40
• 3 讨论40-41
• 第三节 RACK1自噬相关共结合复合物的检测41-44
• 1.材料和方法41-42
• 2 结果42-43
• 3 讨论43-44
• 第四节 RACK1与自噬起始复合体各成分相互作用的探索44-48
• 1 材料和方法44
• 2 结果44-47
• 3 讨论47-48
• 第五节 RACK1和自噬起始复合体各成分之间相互作用形式的探索48-52
• 1 材料和方法48-50
• 2 实验结果50-51
• 3 讨论51-52
• 第六节 RACK1在自噬起始复合体中存在形式52-55
• 1 实验材料和方法52
• 2 实验结果52
• 3 实验结果讨论52-54
• 4 结论54-55
• 第七节 RACK1在自噬复合体中的作用的探索55-57
• 1 材料和方法55
• 2 实验结果55-56
• 3 结论56-57
• 第八节 RACK1对自噬影响的其它通路的探索57-58
• 1 材料和方法57
• 2 实验结果57-58
• 3 结论58
• 本章小结58-59
• 全文总结59-60
• 参考文献60-64
• 综述 P62在自噬、凋亡和肿瘤中作用64-73
• 参考文献71-73
• 硕士期间发表论文73-74
• 致谢74-76

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1 赵亚伟;RACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制[D];河南大学;2015年

  本文关键词：RACK1在肝细胞自噬中的作用和潜在的分子机制，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：344979