不饱和脂肪酸代谢产物前列腺素（PG）对树突状细胞的调控以及机制研究

发布时间：2017-05-04 15:12

  本文关键词：不饱和脂肪酸代谢产物前列腺素（PG）对树突状细胞的调控以及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)是机体生命活动所不可或缺的组分,它非但是细胞膜的重要组成成分,并且各类不饱和脂肪酸呈现出不同的作用,介导机体的促炎或抑炎反应。然而对于其发生作用的分子机制还没有被很好地阐明,本研究通过观察其对免疫系统的重要参与者“树突状细胞”的调控作用的基础上探索其可能的分子机制。方法：1.前列腺素E2及E3对骨髓多能造血干细胞分化成树突状细胞的调控。(1)将骨髓细胞从C57BL/6小鼠的股骨和颈骨中冲出,收集细胞破红后计数,得到骨髓细胞的单细胞悬液。(2)以6×105每孔将细胞种入24孔板中。实验分为3组,第一组在无血清培养基中加入10ng/ml GM-CSF和1ng/ml IL-4,第二和第三组在此基础上分别添加50ng/ml PGE2或50ng／ml PGE3.每天半量换培养液,6天后将细胞吹起收集。(3)计数收集到的细胞,将细胞进行瑞氏染色,在高、低倍镜下拍摄细胞在分化过程中的形态变化。(4)流式检测经前列腺素诱导后CD11b+CD11c+树突状细胞的生成情况,以及Ly6G+CD11b+粒系MDSC细胞的比例,并计数其绝对数,检测前列腺素对于骨髓干细胞分化过程的调控。(5)Q-PC R检测收集后混合细胞和分选CDllc+DC的IL-10、IL-12、IDO、Arg-1以及COX-2的mRNA水平表达情况。(6)由于PPARγ在脂代谢调控中占有非常重要的地位,故我们检测了分别用50ng /ml PGE2和PGE3处理的骨髓干细胞0h、2h、6h、12h、24h时PPARγ的表达情况,探讨其在前列腺素调控中所起的作用。2.前列腺素E2和E3对成熟DC的调控作用。(1)小鼠骨髓细胞在使用GM-CSF以及IL-4诱导7天后,轻轻吹起上层细胞,收集后计数,将细胞以6×105/孔种入24孔板中,以不同种类和浓度前列腺素刺激24小时后,收集细胞进行下一步实验。(2)流式分析前列腺素处理后DC表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子的表达情况。(3)Q-PCR分析不同浓度前列腺素处理组中IL-10、IL-12mRNA水平的表达。(4)在之前实验的基础上,以5Ong/ml前列腺素处理树突状细胞24h后,再以OVA全蛋白与树突状细胞孵育6小时,提呈抗原并活化C57BL/6与DO11.10(BALB/C背景)小鼠的F1代的CD4+T细胞(CD4+ T细胞事先经过磁珠分选并用荧光示踪染料CFSE标记),细胞活化、增殖3天后,流式分析不同组CD4+T细胞的增殖情况。(5)培养7天后的成熟树突状细胞经50ng/ml不同前列腺素处理过后,用OVA-Alexa488与其孵育2h,并且以4℃处理组为对照,流式检测DC细胞吞噬能力的变化。结果：(1)在骨髓干细胞向树突状细胞分化的过程中,如果添加前列腺素,无论是PGE2还是PGE3,都会使诱导后的细胞总数上升,并且瑞氏染色结果显示粒系细胞增多。流式细胞仪检测发现,与对照组相比前列腺素处理组DC的比例下调,粒系来源MDSC细胞比例上调；分泌的免疫抑制性细胞因子例如Arg-1、 IDO、IL-10等均上调。单独分选出CDllc+树突状细胞后定量分析,发现前列腺素处理组DC的免疫抑制型因子与COX-2基因均上调。上述的作用均为PGE2强于PGE3。(2) Western Blotting分析不同前列腺素处理组,不同时间段的PPARγ蛋白的表达,发现经前列腺素处理后的细胞2h后P PARy表达上调。说明前列腺素调控分化过程的作用中,PPARγ可能起了一些作用。(3)对于成熟的DC来说,较低浓度的PGE2 (50ng/ml)调控DC表达更高的CD80、 CD86和MHC-Ⅱ分子,而随着浓度的上升,这些分子的表达受到了抑制。与流式结果相一致,Q-PCR结果发现,在低浓度PGE2时,DC细胞的炎性因子IL-12表达上升而抑炎因子IL-10表达相对较低。综上所述,低浓度的PGE2可以使树突状细胞上调炎症状态,而高浓度时正好相反。(4)横向对比50ng/ml时PGE2和PGE3对树突状细胞的调控功能,发现在这一浓度下,无论是从表型还是从细胞因子分泌上,PGE2-DC的促炎效应显著强于PGE3-DC对比不同前列腺素对DC提呈以及吞噬功能的影响。结果发现提呈能力PGE2-DC要强于,相反,其吞噬能力弱于PGE3-DC结论：在诱导骨髓干细胞向DC分化的过程中,如果加入PGE2和PGE3后,DC的比PGE3-DC。例显著减少,粒系来源的细胞比例明显增高,而且,细胞呈现免疫抑制的状态,MDSC并且这一效应可能与以及PPARy-2上调有关。低浓度的前列腺素可以调控成熟树COX突状细胞上调共刺激分子,以及促炎细胞因子的表达,而在较高浓度的时候则出现抑制。对比相同浓度前列腺素处理的(50ng/ml)口PGE2-DC结果发现树突状细PGE3-DC,胞在经过PGE2处理过后,的抗原提呈能力要强于PGE3处理组,相反吞噬能PGE2-DC力则是强PGE3-DC于PGE2-DC。
【关键词】：不饱和脂肪酸 前列腺素E2 前列腺素E3 骨髓来源的免疫抑制细胞 树突状细胞 过氧化物酶体增殖物激活受体γ
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-16
• 第一章 绪论16-27
• 1.1 前列腺素(PROSTAGLANDIN)16-20
• 1.1.1 前列腺素简介16-17
• 1.1.2 前列腺素的生物学效应17-18
• 1.1.3 PGE_2的受体18-19
• 1.1.4 COX酶与PPARγ19
• 1.1.5 PGE_2和PGE_3对树突状细胞调控的研究现状19-20
• 1.2 树突状细胞20-22
• 1.2.1 树突状细胞的分类20-21
• 1.2.2 树突状细胞的功能21
• 1.2.3 树突状细胞的表面分子21
• 1.2.4 树突状细胞与临床应用21-22
• 1.3 MDSC细胞22-24
• 1.3.1 MDSC的起源22
• 1.3.2 MDSC的表面标志22
• 1.3.3 MDSC的作用及其机制22-23
• 1.3.4 PGE_2与MDSC23-24
• 1.4 本研究的目的、方案设计、及其意义24-27
• 1.4.1 研究目的24
• 1.4.2 研究方法24
• 1.4.3 实验设计24-25
• 1.4.4 研究意义25-27
• 第二章 前列腺素对骨髓多能造血干细胞向树突状细胞分化的调控27-48
• 2.1 实验材料27-29
• 2.1.1 实验动物与试剂27-28
• 2.1.2 主要溶液的配制28
• 2.1.3 仪器与耗材28-29
• 2.2 实验方法29-35
• 2.2.1 小鼠骨髓细胞的制备及树突状细胞的诱导29-30
• 2.2.2 瑞氏染色步骤30
• 2.2.3 细胞表面分子的标记30-31
• 2.2.4 Western Blotting31
• 2.2.5 RNA的提取以及定量PCR步骤31-33
• 2.2.6 树突状细胞分选33
• 2.2.7 CD4~+T细胞增殖实验(体外)33-34
• 2.2.8 树突状细胞的吞噬功能实验(体外)34-35
• 2.2.9 统计学分析35
• 2.3 实验结果35-46
• 2.3.1 前列腺素处理细胞量的变化35-36
• 2.3.2 前列腺素处理组粒系细胞变化36-37
• 2.3.3 前列腺素处理组粒系MDSC细胞比例改变37-38
• 2.3.4 前列腺素处理组免疫抑制性细胞因子分泌量38
• 2.3.5 前列腺素对分化后树突状细胞免疫抑制型因子分泌的调控38-39
• 2.3.6 前列腺素对分化后的树突状细胞COX-2表达的调控39-40
• 2.3.7 前列腺素处理后细胞PPARγ的表达40
• 2.3.8 前列腺素处理组树突状细胞比例的变化40-42
• 2.3.9 不同前列腺素对成熟的树突状细胞的表型调控42-43
• 2.3.10 不同的前列腺素对成熟树突状细胞细胞因子分泌的影响43-44
• 2.3.11 不同前列腺素对成熟树突状细胞刺激CD4~+T细胞增殖能力的调控44-45
• 2.3.12 不同前列腺素对成熟的树突状细胞吞噬抗原能力的影响45-46
• 2.4 讨论46-48
• 第三章 结论与展望48-49
• 3.1 主要的结论48
• 3.2 展望48-49
• 参考文献49-57
• 综述：树突状细胞疫苗治疗肿瘤的研究进展57-63
• 综述参考文献61-63
• 致谢63-64
• 攻读硕士学位期间发表的文章及专利64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王一;黎燕;;髓样来源抑制性细胞的研究进展[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2011年04期

  本文关键词：不饱和脂肪酸代谢产物前列腺素（PG）对树突状细胞的调控以及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：345312