人PD-L1基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制

发布时间：2017-05-06 00:08

  本文关键词：人PD-L1基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：PD-L1属于共刺激分子B7家族成员,含有290个氨基酸,是I型跨膜蛋白。PD-L1广泛表达于T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞及一些非造血细胞。PD-L1与其受体PD-1结合后传递抑制信号,在T细胞的活化、耐受和免疫介导的组织损伤中发挥负性免疫调节作用,参与机体免疫稳态的维持。PD-1/PD-L1途径与自身免疫性疾病、移植排斥反应、慢性病毒感染及肿瘤免疫等疾病的发生、发展密切相关。PD-L1分子在多种肿瘤组织中表达,与肿瘤细胞的分化程度、TNM分期及不良预后密切相关,可作为多种肿瘤诊断和预后标志物及诊断和治疗的靶点。本文构建了稳定表达人PD-L1分子的基因转染细胞株L929/PD-L1,观察了PD-1/PD-L1途径对活化Jurkat细胞增殖与凋亡的影响,证实PD-L1的负性免疫调控作用;以L929/PD-L1为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,建立了稳定分泌特异性鼠抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并初步研究单抗的生物学特性。一、人PD-L1基因转染细胞株的构建及其对活化Jurkat细胞增殖和凋亡的影响【目的】构建稳定表达人PD-L1分子的基因转染细胞株,并鉴定其生物学活性。【方法】将编码人PD-L1分子的全长c DNA重组入逆转录病毒表达载体p EGZ-Term-R,采用脂质体法将重组载体p EGZ-Term-R/PD-L1和辅助的病毒载体共转染293T细胞,包装具有感染能力的完整病毒,收集含有完整重组逆转录病毒的细胞培养上清,感染L929细胞,筛选并获得G418抗性的基因转染细胞。采用流式细胞术筛选并获得表达PD-L1的基因转染细胞,命名为L929/PD-L1。采用PHA活化T细胞系来源的细胞株Jurkat,并将其与丝裂霉素预处理的L929/PD-L1细胞共培养,用细胞计数法观察L929/PD-L1细胞株对活化Jurkat细胞增殖能力的影响,并检测其凋亡情况。【结果】成功获得了稳定表达人PD-L1的基因转染细胞株L929/PD-L1。PHA可诱导Jurkat细胞活化并表达PD-1分子;L929/PD-L1与PHA刺激后Jurkat细胞共培养,可抑制Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。【结论】成功构建了稳定表达人PD-L1分子的基因转染细胞株,PD-L1分子对活化Jurkat细胞增殖的抑制和凋亡的促进,进一步证实了PD-1/PD-L1途径的负性免疫调控作用,也为进一步探讨PD-L1的生物学作用奠定了基础。二、鼠抗人PD-L1单克隆抗体的研制【目的】研制鼠抗人PD-L1单克隆抗体,为探讨PD-1/PD-L1途径在免疫病理机制中的作用奠定物质基础。【方法】以L929/PD-L1为免疫原免疫6-8周龄的BALB/c雌鼠,将骨髓瘤细胞P3X63Ag8与免疫小鼠的脾脏细胞融合,采用HAT和HT选择性培养基筛选杂交瘤。以L929/PD-L1细胞株为阳性筛选抗原,采用流式细胞术鉴定、有限稀释法亚克隆、western blot鉴定等筛选分泌特异性鼠抗人PD-L1单抗的杂交瘤细胞株;利用小鼠免疫球蛋白亚类快速定性试纸鉴定单抗亚型;以L929/PD-L1细胞为抗原,采用竞争抑制试验结合流式细胞术分析单抗的识别位点;进而比较所获单抗与商品化单抗MIH1对肿瘤细胞株表达的PD-L1分子的识别。【结果】成功获得l株能够持续稳定分泌鼠抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6G4;经小鼠免疫球蛋白亚类快速定性试纸分析鉴定,6G4的重链为Ig M,轻链为κ链;竞争实验显示,单抗6G4与商品化抗人PD-L1单抗MIH1识别的抗原表位不同;另外,单抗6G4与单抗MIH1类似,能够特异性识别肿瘤细胞株表达的PD-L1分子。【结论】成功建立了稳定分泌鼠抗人PD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G4,该单抗可用于免疫荧光标记、流式细胞术以及western blot检测PD-L1分子的表达,为进一步应用于临床检测PD-L1分子的表达及PD-L1介导的免疫病理机制研究奠定了物质基础。
【关键词】：PD-L1 基因转染 单克隆抗体
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 研究背景11-28
• 1 PD-L1 及其受体的结构与表达谱11-13
• 2 PD-L1 的生物学作用13-14
• 3 PD-1/PD-L1 途径与疾病的关系14-17
• 4 靶向 PD-L1 在肿瘤免疫治疗中的研究进展17-20
• 参考文献20-28
• 第一部分 人PD-L1 基因转染细胞株的构建及其对活化JURKAT细胞增殖和凋亡的影响28-40
• 材料和方法28-32
• 结果32-35
• 讨论35-37
• 参考文献37-40
• 第二部分 鼠抗人PD-L1 单克隆抗体的研制40-55
• 材料与方法40-44
• 结果44-50
• 讨论50-52
• 参考文献52-55
• 小结与展望55-56
• 发表论文和参与科研项目56-57
• 本研究所获的基金资助57-58
• 中英文对照缩略词表58-60
• 致谢60-62

【参考文献】

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1 Zhixue Zheng;Zhaode Bu;Xijuan Liu;Lianhai Zhang;Ziyu Li;Aiwen Wu;Xiaojiang Wu;Xiaojing Cheng;Xiaofang Xing;Hong Du;Xiaohong Wang;Ying Hu;Jiafu Ji;;Level of circulating PD-L1 expression in patients with advanced gastric cancer and its clinical implications[J];Chinese Journal of Cancer Research;2014年01期

  本文关键词：人PD-L1基因转染细胞株的构建及其单克隆抗体的研制，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：347357