人破骨细胞分化因子（ODF）重组表达载体的构建及其表达的初步研究

发布时间：2021-11-09 11:50

　　破骨细胞分化因子（osteoclast differentiation factor，ODF）是近年来新发现的重要的骨代谢调节因子，它已经成为代谢性骨病领域的研究热点。ODF作用复杂，无论在正常的生理状态下，还是在异常的病理状态下，其效应实现的途径，效应的调节等机制尚未完全阐明。用基因工程制备大量的ODF，可以为进一步的研究提供物质基础。 本研究选择了具有功能活性的人ODF可溶片段（aa 145-317）cDNA，分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行了克隆表达。大肠杆菌表达系统操作简便，能够快速获得蛋白，可制备相应的抗体。哺乳动物细胞表达的蛋白有优良活性，可以满足功能研究的需要。 在大肠杆菌表达系统中，PCR扩增人ODF可溶片段cDNA，然后将扩增片段插入到原核表达载体pET42a的多克隆位点——PshA Ⅰ酶切位点处，构建为重组融合表达载体pET42a／ODF。经酶切和测序鉴定后，重组融合表达载体转化E．Coli BL21（DE3）进行表达。超声裂解细菌，SDS-PAGE鉴定裂解物中是否含有重组融合ODF蛋白。Western Blot鉴定融合蛋白是否具有免疫原性。 在... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

重组质粒KPnl酶切图1一5孟组质粒Hindm醉切

融合蛋白转膜后经显色，与蛋白分子量比较，可见一条略大于43KDa的条带，其位置与重组质粒诱导表达产物转膜后氨基黑染色的特异性条带位置相一致(图1一7，5道)。说明重组蛋白确系ODF融合蛋白。

，{{{{{{’x1osxm’兵兵兵一一一-」里坚一一-一一一图1一8本试验采用表达宿主E.。。LiBL21(OE3)和pET质粒的表达控制PshA工单酶切进行操作，和双酶切的定向连接比，简化了操作，降低了载体的损失，但是PshAI酶切产物为平端切口，且试验中连接反应直接使用5’端没有磷酸基团的PCR产物，酶切后的载体不能去磷酸化，使连接效率减低，载体的自连机率加大。为了增加连接的成功机率，采取如下措施(1)适当增加连接反应液的体积以增加目的片段和载体的浓度:(2)提高连接温度以利连接酶发挥最大的效率:(3)适当延长连接反应的时间;(4)转化宿主菌时，用丰富营养培养基SOC预培养。结果一次性顺利连接成功，在15个转化菌落中筛选到一个正向连接的重组子。表达外源蛋白时，宿主菌生长4小时，诱导4小时后超声碎菌

【参考文献】：
期刊论文
[1]利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展[J]. 毕永春.  国外医学(分子生物学分册). 2001(05)

硕士论文
[1]重组谷氨酸脱羧酶（GAD）在BL-21细胞中的表达及条件优化[D]. 油红捷.天津医科大学 2002



本文编号：3485277