大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及其初步应用

发布时间：2017-05-07 11:11

  本文关键词：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及其初步应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LT)是分泌到细胞周质的一种热不稳定肠毒素,它由A、B两个亚单位组成,能导致旅行者和猪等家畜的严重腹泻,目前还没有预防此疾病的有效疫苗。LT不仅具有很强的黏膜免疫原性,还拥有较强的黏膜免疫佐剂效应。由于LTA的毒副作用限制了其应用,我们将无毒性的B亚单位作为研究对象。我们试图通过制备LTB重组蛋白,研究其作为疫苗预防幼畜腹泻的可能性,并将其与减毒沙门氏菌疫苗共同免疫BALB/c小鼠,以研究其黏膜免疫佐剂效应。研究目的：研究LTB作为疫苗预防幼畜腹泻的可能性；研究LTB作为黏膜免疫佐剂对减毒沙门氏菌疫苗的佐剂效应。研究方法：查阅GenBank中公布的LTB基因序列,利用软件设计引物,PCR扩增LTB目的基因,载体质粒pCold-TF和PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,将回收的载体和LTB片段用T4连接酶连接,构建pCold-TF/LTB重组质粒,对重组质粒进行鉴定。将pCold-TF/LTB重组质粒转化入大肠杆菌BL21,接着用IPTG进行低温过夜诱导表达,取上清通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证后再通过His标签亲和纯化,获得可溶性蛋白TF/LTB,用ELISA对纯化后的TF/LTB蛋白进行鉴定。纯化的TF/LTB蛋白用来免疫BALB/c小鼠,三免后用间接ELISA法对血清和粪便的IgG和IgA水平进行检测,并用肠毒素大肠杆菌ETEC K88对免疫后的小鼠进行免疫保护实验,用来研究LTB作为疫苗预防幼畜腹泻的可能性。沙门氏菌减毒疫苗与纯化的TF/LTB蛋白三免后同样用间接ELISA法检测粪便中的IgA水平,用来研究LTB的黏膜免疫佐剂效应。研究结果：通过PCR成功扩增LTB基因；成功构建pCold-TF/LTB重组质粒；获得TF/LTB重组蛋白；TF/LTB作为疫苗预防幼畜腹泻有一定效果；TF/LTB对沙门氏菌减毒疫苗具有黏膜免疫佐剂效应。研究结论：重组TF/LTB为预防幼畜腹泻疫苗的研究提供了有利工具；TF/LTB能够作为减毒沙门氏菌疫苗的黏膜免疫佐剂。
【关键词】：大肠杆菌不耐热肠毒素 重组蛋白TF/LTB 表达纯化 疫苗 黏膜佐剂
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.21
【目录】：

• 摘要2-3
• ABSTRACT3-6
• 符号说明6-8
• 第一部分 LTB基因的克隆与原核表达载体的构建8-20
• 1 材料8-11
• 2 方法11-16
• 3 结果16-18
• 4 讨论18-19
• 参考文献19-20
• 第二部分 重组蛋白的表达及其鉴定20-36
• 1 材料20-24
• 2 方法24-29
• 3 结果29-34
• 4 讨论34-35
• 参考文献35-36
• 第三部分 重组蛋白的初步应用36-46
• 1 材料36
• 2 方法36-38
• 3 结果38-42
• 4 讨论42-44
• 参考文献44-46
• 综述46-54
• 参考文献50-54
• 致谢54-55

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 程茜,刘作义;肠道菌群与肠黏膜免疫[J];中国微生态学杂志;2003年04期

2 徐辉;黏膜免疫调节的研究进展[J];免疫学杂志;2004年02期

3 王月华,刘肇杰,范永琛;气道黏膜免疫及其影响因素研究进展[J];中国实用儿科杂志;2004年09期

4 张小飞,杨倩;黏膜免疫佐剂的研究进展[J];免疫学杂志;2004年S1期

5 甘慧泉,吴忠道;黏膜免疫及其在疫苗研制中的应用[J];热带医学杂志;2004年06期

6 杨贵波,邵一鸣;人类免疫缺陷病毒与黏膜免疫[J];世界华人消化杂志;2005年14期

7 俞善昌;;黏膜免疫反应与呼吸道过敏性疾病[J];临床儿科杂志;2007年01期

8 王淑玲;刘来成;卢贤瑜;;卡介苗的黏膜免疫途径[J];微生物与感染;2007年03期

9 白雪飞;郭静玉;雷万军;段广才;;黏膜免疫系统及黏膜免疫佐剂的研究进展[J];河南科技大学学报(医学版);2008年04期

10 张俊玲;王新美;朱永芹;;黏膜免疫研究进展[J];现代临床医学;2008年05期

中国重要会议论文全文数据库 前7条

1 陈柏君;熊磊;;论急性上呼吸道感染与黏膜免疫的关系[A];第25届全国中医儿科学术研讨会暨中医药高等教育儿科教学研究会会议学术论文集[C];2008年

2 王金玲;常建军;彭景ii;;精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)基因疫苗黏膜免疫不育的研究[A];第九次全国生殖生物学学术研讨会论文摘要集[C];2003年

3 张艳丽;李风森;;“肺主皮毛”理论在哮喘、荨麻疹患者发病过程中的体现及与黏膜免疫相关性研究[A];第五届全国中西医结合变态反应学术会议论文集[C];2011年

4 张辉;焦新安;;鞭毛蛋白嵌合表达结核分枝杆菌ESAT-6的黏膜免疫特性[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

5 李杭;吴国豪;陈吉;;GLP-2对肠道缺血再灌注后黏膜免疫和相关细胞因子影响的实验研究[A];2004年浙江省外科学学术年会论文汇编[C];2004年

6 李风森;徐丹;;哮喘黏膜免疫中“肺鼻同治”理论的体现[A];全国中医内科肺系病第十四次学术研讨会论文集[C];2010年

7 张小飞;杨倩;;几种黏膜免疫佐剂对小肠树突状细胞、MHC Ⅱ类分子及核转录因子NF-kB的影响[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十五次学术研讨会论文集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前2条

1 黄萍;增强黏膜免疫功能预防癌症[N];人民日报海外版;2006年

2 陈革飞;黏膜抗体防鸡病[N];中国畜牧兽医报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 高燕;肠道传播肝炎病毒的黏膜免疫研究[D];中国疾病预防控制中心;2015年

2 张辉;重组沙门菌表达结核分枝杆菌保护性抗原ESAT-6、CFP-10及其黏膜免疫机理研究[D];扬州大学;2008年

3 刘颂;经典CD103+树突状细胞介导下DNA与脂蛋白竞争性调节黏膜免疫应答的机制研究[D];南京大学;2015年

4 麻粉莲;JY佐剂对人乳头瘤病毒（HPV）和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）疫苗黏膜免疫研究[D];中国疾病预防控制中心;2013年

  本文关键词：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及其初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：349751