结核分枝杆菌持续感染致T细胞功能障碍的研究及融合蛋白AEMD和LT70的构建

发布时间：2017-05-07 20:14

  本文关键词：结核分枝杆菌持续感染致T细胞功能障碍的研究及融合蛋白AEMD和LT70的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分结核分枝杆菌持续感染致T细胞功能障碍的研究目的：研究导致慢性重症结核病患者对结核分枝杆菌免疫力降低的机制,探究结核分枝杆菌长期感染持续激活机体免疫应答是否造成T细胞功能障碍。方法：从兰州市肺科医院在2013年1月-2014年12月期间收住入院的所有肺结核患者中,抽取35例患者为实验组,其中12名为痰菌阳性的空洞性肺结核患者。从兰州大学志愿者中抽取6人为正常对照组,采集实验组和对照组的外周血标本,从收集到的人血标本中分离出淋巴细胞。通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析T淋巴细胞IFN-γ和IL-2分泌水平,用细胞增殖试验分析T细胞的增殖能力,用流式细胞仪检测细胞表面免疫抑制相关分子TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3)的表达以及CD4+、CD8+T细胞数目的变化。结果：试验结果显示,与健康人相比,痰菌阴性的结核病患者T细胞的增殖能力明显增强。与健康人和痰菌阴性的结核病患者相比痰菌阳性的空洞性结核病患者T细胞的增殖能力明显下降。与健康人相比,痰菌阳性的非空洞性结核病患者T细胞IFN-γ的分泌能力明显增强。但是,与痰菌阳性的非空洞性结核病患者相比,痰菌阳性的空洞性结核病患者T细胞IFN-γ的分泌能力明显下降。与健康人相比较痰菌阳性的非空洞性结核病患者和痰菌阳性的空洞性结核病细胞表面免疫抑制相关分子TIM-3的表达增高。但是,结核病患者组之间相比较TIM-3的表达无显著性差异。与健康人相比结核病患者T细胞IL-2的分泌水平明显下降,而结核病患者组之间T细胞IL-2的分泌水平无显著性差异。按照患者的年龄分组时,各组之间均不存在差异。结论：痰菌阳性的空洞性结核病中,结核分枝杆菌的持续刺激会造成患者T淋巴细胞的功能减弱,T淋巴细胞增殖能力下降。第二部分融合蛋白AEMD和LT70的构建目的：构建融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD(AEMD)和ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(LT70),使其在大肠杆菌BL-21(DE3)中能够稳定表达。通过密码子优化和加入linker的方法使其更多的表达在上清中,各个抗原能够正确折叠互不干扰。方法：1.融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD的构建：根据GenBank中结核分枝杆菌基因esat6、mtb8.4、rpfd的序列设计引物进行PCR,在酶切位点Bgl Ⅱ、SacⅠ、Hind Ⅲ处依次插入到表达载体pET-30a(+)中,基因ag85b酶切后在酶切位点Nde Ⅰ、 Bgl Ⅱ处插入到表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD- pET-30a(+),将此质粒转化入大肠杆菌BL-21(DE3)中表达融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD。由于实验室已经构建好ESAT6-Mtb8.4的序列,所以根据ESAT6-Mtb8.4两端的序列设计引物。根据实验室以前做的融合蛋白的经验,把Ag85B放在融合蛋白的前面时,蛋白不表达,因此此次设计融合蛋白时,对Ag85B进行了优化,首先是对Ag85B的序列进行优化,再次是在Ag85B与ESAT6之间加入了linker GGGGS。2.融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c的优化：在实验室原有融合蛋白Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c的基础上,将ag85b的序列进行密码子优化,并在其两端加入linker (GGGGS) 3。设计好的ag85b序列送去合成,合成时其两端的酶切位点与原来Ag85B序列两端的酶切位点一致。在酶切位点EcoR Ⅰ、 Bgl Ⅱ处插入表达载体中,构建重组质粒ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c- pET30a(+),将此质粒转化入大肠杆菌BL-21(DE3)中表达融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c。结果：融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD和ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c成功构建,并且其在大肠杆菌BL-21(DE3)中能够稳定表达。和优化前相比,两种融合蛋白在上清中的表达都相对提高。结论：经过密码子优化和linker的加入, 提高了融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD和ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c的表达效率。此外,密码子的优化和linker的加入能使各个抗原正确折叠,融合蛋白更多地表达在上清中。
【关键词】：结核病 空洞性结核 T淋巴细胞增殖 TIM-3 T细胞功能障碍 结核分枝杆菌 融合蛋白 密码子优化 接头
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一部分 结核分枝杆菌持续感染致T细胞功能障碍的研究11-38
• 前言11-13
• 1.1 材料与仪器13-15
• 1.1.1 研究对象13-14
• 1.1.2 实验材料14
• 1.1.3 实验仪器14-15
• 1.2 实验方法15-24
• 1.2.1 ESAT6蛋白的表达与纯化15-17
• 1.2.2 CFP10的表达与纯化17
• 1.2.3 HspX蛋白的表达与纯化17-18
• 1.2.4 ESAT6、HspX、CFP10蛋白质SDS-PAGE电泳18-20
• 1.2.5 ESAT6、HspX和CFP10蛋白质浓度测定20-21
• 1.2.6 完全细胞培养基的配制21
• 1.2.7 分泌IFN-γ的单核淋巴细胞细胞数的检测21-23
• 1.2.8 ELISA技术检测IL-2的分泌水平23-24
• 1.3 实验结果24-34
• 1.3.1 单个抗原ESAT6的表达和纯化的结果24
• 1.3.2 单个抗原HspX的表达和纯化结果24-25
• 1.3.3 单个抗原CFP10的表达和纯化结果25-26
• 1.3.4 不同人群T细胞分泌IFN-γ水平的检测26-28
• 1.3.5 不同人群的T淋巴细胞表面分子的表达情况28-31
• 1.3.6 不同人群之间特异性T淋巴细胞增殖能力的比较31-33
• 1.3.7 不同人群T淋巴细胞分泌IL-2的水平33-34
• 1.4 讨论34-37
• 1.5 结论37-38
• 第二部分 融合蛋白AEMD和LT70的构建38-57
• 前言38-39
• 2.1 材料与仪器39-40
• 2.1.1 实验材料39-40
• 2.1.2 实验仪器40
• 2.2 试验方法40-48
• 2.2.1 融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD(AEMD)的构建40-43
• 2.2.2 利用氯化钙法制造大肠杆菌E.coli DH5α的感受态细胞43-44
• 2.2.3 向DH5α感受态细胞中转化连接产物44
• 2.2.4 融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)的优化44-45
• 2.2.5 融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD和ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c的表达45-46
• 2.2.6 SDS-PAGE蛋白电泳的方法及其相关试剂的配制46-48
• 2.3 结果48-54
• 2.3.1 重组质粒Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD-pET30a(+)的构建48-51
• 2.3.2 融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD的表达51-52
• 2.3.3 重组质粒ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c-pET30a(+)的优化52-53
• 2.3.4 融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c的表达53-54
• 2.4 讨论54-56
• 2.5结论56-57
• 参考文献57-63
• 攻读硕士学位期间发表的论文和成果63-64
• 致谢64

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张志祥,姚其正;融合蛋白—— 一种新的生物工程技术[J];药物生物技术;2001年01期

2 李大鹏,王莉,卫红飞,张培因,吴秀丽,万敏,王燕媚,王爱丽,杨世杰,王丽颖;热休克蛋白65-MUC1融合蛋白对小鼠干扰素γ产生细胞的诱生作用[J];吉林大学学报(医学版);2004年03期

3 曲梅花;于继云;胡美茹;王守训;黎燕;;人CD28-Fc融合蛋白在真核细胞中的表达与纯化[J];医学分子生物学杂志;2005年05期

4 张荣媛;王静;李茜;王航雁;;融合蛋白技术及临床应用进展[J];国际生物制品学杂志;2006年02期

5 何火聪;刘树滔;潘剑茹;陈躬瑞;饶平凡;;GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定[J];福建医科大学学报;2006年04期

6 严世荣;闫莹;孙军;宗义强;王小波;屈伸;;TAT-EGFP融合蛋白对小鼠生物膜穿透性的研究[J];药物生物技术;2007年05期

7 马大龙,郭淑君,郑蕾,陈慰峰;在大肠杆菌高效表达人白细胞介素4融合蛋白[J];北京医科大学学报;1990年04期

8 杨和平，，黄宗之;融合蛋白的生产技术[J];中国动脉硬化杂志;1994年04期

9 廉德君,许根俊;一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法[J];生物化学与生物物理进展;1998年03期

10 李文平,许静,隋建华,宋增璇;抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的稳定性及对动物纤维蛋白的识别[J];中国免疫学杂志;1999年09期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 祝强;黄智华;黄予良;覃扬;;rhEPO-L-Fc融合蛋白的克隆、表达、生物活性分析及初步药代动力学研究[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年

2 高基民;吕建新;;白细胞介素15/链亲和素融合蛋白的制备及活性测定[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）[C];2008年

3 孙益;葛霁光;;人睫状神经营养因子和可溶性人睫状神经营养因子受体的融合蛋白的表达[A];中国生物医学工程学会第六次会员代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2004年

4 杨振泉;刘巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在转基因水稻叶片中的表达及其免疫原性[A];中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2005年

5 陈丽华;王强;侯万国;;不同链接剂修饰的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中国化学会第十二届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2009年

6 王荣智;汪世华;林文雄;;抗体与酶融合技术研究[A];第十届全国杀虫微生物学术研讨会暨全国生物农药与化学生物学研究与产业化会议论文摘要集[C];2006年

7 刘忠华;丁元生;胡忠义;;结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达[A];2007年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2007年

8 祖东;徐春晓;黄国锦;姚立红;陈爱君;朱宏建;刘沐荣;张智清;;TNFRI∶IgGFc融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的高效表达[A];首届长三角科技论坛——长三角生物医药发展论坛论文集[C];2004年

9 刘先俊;刘方欣;黎波;周辉云;王琴琴;;胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年

10 杨燕凌;;酶(蛋白)融合技术研究[A];华东地区农学会学术年会暨福建省科协第七届学术年会农业分会场论文集[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 朱敏丽　通讯员 潘越;中国医药城首批融合蛋白试剂出口[N];泰州日报;2010年

2 吴红梅;我省首批融合蛋白试剂出口美国[N];新华日报;2010年

3 金陵;融合蛋白试剂首次出口美国[N];中国医药报;2010年

4 记者 毛黎;美开发出癌症治疗新技术[N];科技日报;2009年

5 常丽君;线粒体融合蛋白2决定细胞生死[N];科技日报;2013年

6 通讯员 沈季 记者 张兆军;抗肿瘤融合蛋白进入临床试验[N];科技日报;2005年

7 记者 张晔　通讯员 刘宁春;一种有效治疗冠心病的融合蛋白发现[N];科技日报;2009年

8 ;吉大抗肿瘤生物工程新药进入临床试验[N];中国高新技术产业导报;2005年

9 毛磊;新型抗流感药物有望面世[N];医药经济报;2003年

10 曹丽君;英研制出新型抗流感药物[N];中国中医药报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 杨晶;三组治疗艾滋病的靶向融合蛋白的基因工程研究[D];中国协和医科大学;2004年

2 侯s

本文编号：350534