VZV糖蛋白E基因胞外域的克

发布时间：2017-05-11 13:04

  本文关键词：VZV糖蛋白E基因胞外域的克隆、表达及其应用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:分别用原核和真核细胞稳定表达水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,g E)的基因胞外域,对融合蛋白进行特异性鉴定和免疫反应性分析,将这两种融合蛋白分别免疫新西兰家兔,制备兔抗VZV g E多克隆抗体;应用融合蛋白作为抗原建立检测VZV特异性抗体的血清学试验,开展对VZV感染的流行病学调查,以评价VZV疫苗的免疫效果,为易感人群VZV感染的诊断和治疗以及水痘预防措施的制定提供重要的实验依据,并为研制安全性更高的VZV g E亚单位疫苗奠定基础。方法:从临床采集带状疱疹患者的皮肤囊泡液接种至单层人胚胎成纤维细胞(human embryo fibroblast,HF),进行病毒分离;对分离的病毒株进行特征性细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),间接免疫荧光和DNA测序鉴定。将确认的VZV临床分离株体外培养,PCR扩增VZV g E基因胞外域片段,分别构建原核表达质粒g E-p ET-32a(+)和真核表达质粒g E-p CDNA3.1/myc-His(-),测序后将原核质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,获得VZV g E原核表达的融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳、Western blot鉴定融合蛋白的特异性,利用Ni2+-NTA柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。将真核质粒用脂质体介导转染至COS-7细胞,经G418筛选出稳定表达VZV g E蛋白的细胞株,表达产物经Ni2+-NTA柱纯化;通过RT-PCR检测VZV g E基因的m RNA,Western blot和间接免疫荧光检测g E融合蛋白的免疫反应性。分别用纯化后的原核表达g E蛋白和真核表达g E蛋白免疫新西兰家兔,获得兔抗VZV g E多克隆抗体。ELISA法分别测定该抗体及其效价。应用真核细胞表达的g E重组抗原包被ELISA酶标板,建立VZV抗体检测的血清学试验。对127份0~10岁正常儿童血清中VZV Ig G抗体水平进行检测,以评价VZV疫苗的免疫效果。结果:利用原核表达,成功诱导表达出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鉴定表明其为包涵体表达,表达量约为3.01 mg/ml,Ni2+-NTA柱纯化后,g E蛋白纯度约为90%。Western blot显示,经变性、复性后的该融合蛋白具有良好的免疫反应性。免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV g E多克隆抗体,ELISA测定显示,多克隆抗体效价为1:6400~1:12800;利用真核表达,成功筛选出能够稳定表达VZV g E基因胞外域的COS-7细胞株,RT-PCR检测到相应的m RNA,间接免疫荧光和Western blot鉴定,该g E融合蛋白具有较强的免疫反应性;COS-7细胞株和其培养液中均有g E融合蛋白,表达量约为0.632 mg/ml,Ni2+-NTA柱纯化后,g E蛋白纯度约为90%。免疫新西兰家兔后获得兔抗VZV g E多克隆抗体,ELISA测定显示,多克隆抗体效价为1:25600~1:51200。应用真核g E抗原包被ELISA板,检测了127份0~10岁儿童血清中VZV Ig G抗体,总阳性率为81.89%,特异度和灵敏度分别为93.75%和88.24%。结论:本实验成功构建了稳定高效表达VZV g E蛋白的原核表达和真核表达系统,获得较高纯度的g E蛋白,有利于全面研究此蛋白的生物学功能,并为VZV亚单位疫苗的制备奠定基础。制备了特异性及效价较高的兔抗VZV g E多克隆抗体,建立了快速诊断VZV感染的ELISA血清学试验,有助于VZV疫苗免疫效果的监测和VZV感染的流行病学调查,为水痘预防措施的制定提供了重要的实验依据。
【关键词】：水痘-带状疱疹病毒 糖蛋白E 原核表达 真核稳定表达 多克隆抗体 血清学试验 疫苗效果
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 第一部分VZV糖蛋白E基因胞外域的原核和真核细胞的克隆及稳定表达11-29
• 1 引言11-14
• 1.1 VZV相关疾病11-12
• 1.2 VZV疾病的研究进展与防治途径12-13
• 1.3 VZV糖蛋白E的生物学功能13-14
• 2 材料和方法14-20
• 2.1 材料14-16
• 2.2 方法16-20
• 3 结果20-27
• 3.1 病毒分离与鉴定20-22
• 3.2 原核重组质粒g E-p ET-32a(+)和真核g E-p CDNA3.1/myc-His(-) 的构建与鉴定22-23
• 3.3 原核表达VZV gE融合蛋白的表达及柱上复性、纯化的鉴定23-25
• 3.4 真核表达 VZV g E 融合蛋白鉴定与纯化25-27
• 4 讨论27-28
• 4.1 原核表达gE重组蛋白27-28
• 4.2 真核表达gE重组蛋白28
• 5 结论28-29
• 第二部分VZV糖蛋白E的应用研究29-44
• 1 引言29-30
• 2 材料和方法30-35
• 2.1 材料30-32
• 2.2 方法32-35
• 3 结果35-40
• 3.1 VZV g E抗原制备的多克隆抗体效价测定35
• 3.2 兔抗VZV gE多克隆抗体的特异性鉴定及纯化35-37
• 3.3 Protein A亲和层析柱纯化兔抗VZV gE多克隆抗体37-38
• 3.4 ELISA实验检测临床血清标本38-40
• 4 讨论40-43
• 4.1 VZV的临床诊断40
• 4.2 VZV的实验室诊断40-41
• 4.3 VZV gE糖蛋白的临床应用41-42
• 4.4 水痘疫苗免疫策略的探讨42-43
• 4.5 本研究的不足之处及下一步研究目标43
• 5 结论43-44
• 参考文献44-50
• 综述50-59
• 参考文献56-59
• 附录一VZV g E N端亲水胞外域蛋白氨基酸序列59-60
• 附录二 简历60-61
• 附录三 致谢61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王敏力;沈琦;;水痘-带状疱疹免疫球蛋白研究进展[J];中国生物制品学杂志;2007年09期

2 甘霖;王明丽;陈敬贤;;水痘减毒活疫苗的研究进展[J];微生物与感染;2009年01期

3 伊兴旭;甘霖;陈敬贤;王明丽;;水痘-带状疱疹病毒疫苗的评价与研究进展[J];微生物与感染;2014年04期

  本文关键词：VZV糖蛋白E基因胞外域的克隆、表达及其应用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：357286