分枝杆菌脂质组分加强结核亚单位疫苗效应的初步研宄

发布时间：2017-05-12 03:07

  本文关键词：分枝杆菌脂质组分加强结核亚单位疫苗效应的初步研宄，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：分枝杆菌细胞壁含丰富的脂质组分,其中的一些组分具有抗原性,或具有重要的免疫调节作用。本实验通过筛选分枝杆菌细胞壁脂质成分中具有抗结核作用的组分并初步研究这些脂质组分在结核亚单位疫苗中的作用,为后续研发有效的结核亚单位疫苗做准备。方法：本研究用有机溶剂对卡介苗(BCG)细胞壁总脂成分进行萃取,用硅胶柱色谱法将其分离为非极性脂、中间极性脂和极性脂。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各类脂质组分在人群中的免疫原性,酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测各类脂质组分对人群T细胞的免疫反应,并将总脂和各类脂质组分分别与佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)-聚肌胞(PolyI:C)混合,进一步与结核分枝杆菌融合蛋白LT70 (ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c,简称LT70)混合,构建含脂质的结核亚单位疫苗,分别在在小鼠BCG攻击模型和家兔皮肤BCG攻击结核液化模型中进行保护效率评价。利用小鼠BCG攻击模型的保护效率评价,包括进行BCG初免后含脂质亚单位疫苗的强化免疫保护效率评价。单独疫苗免疫策略组,用LT70-脂质疫苗在0、3、6周时连续免疫BABL/c小鼠三次；BCG初免-含脂质亚单位疫苗加强策略组,用BCG在0周时免疫BABL/c小鼠一次,再用LT70-脂质疫苗在9、12周时加强免疫BABL/c小鼠两次。两种策略均用BCG和磷酸缓冲液(PBS)免疫组为对照组。末次免疫后5周,滴鼻感染小鼠,3周后检测小鼠肺脏BCG菌载量,以此评价LT70-脂质疫苗的保护效率和强化免疫保护效率。利用家兔皮肤结核液化模型评价研究含脂质亚单位疫苗保护效率,用LT70-脂质疫苗在0、3、6周时连续免疫家兔三次,BCG组在0周时免疫BCG一次,PBS免疫组为对照。末次免疫后6周,家兔腹背部皮内注射BCG,形成家兔皮肤结核感染病灶。每天观察感染灶结节的出现及病理发展过程,测量结核结节的大小及记录结核结节到达肉芽肿、破溃、液化高峰以及愈合的时间,当结节到达液化高峰时收集各组家兔皮肤结核结节中的液化物质,对其中的结核菌载量进行计数,评价LT70-脂质疫苗的保护效率。结果：结核病患者脂质特异性抗体IgG高于健康人群(P0.05)。在小鼠卡介苗攻击模型免疫保护效果评价中,含脂质亚单位疫苗LT70-总脂组小鼠肺部荷菌数明显低于BCG组(P0.05)。在BCG初免-含脂质亚单位疫苗加强免疫策略中,LT70-总脂和LT70-中间极性脂组小鼠肺荷菌数均低于BCG组(P0.01)和LT70组(P0.05)。在家兔皮肤结核液化模型免疫保护效果评价中,含脂质亚单位疫苗LT70-总脂组和LT70-中性脂组家兔皮肤结核结节液化高峰时的荷菌数低于LT70组,差异无统计学意义(P0.05)。动态观察家兔皮肤结核结节结果表明：脂质可以加快家兔皮肤结核结节发生发展进程,BCG组和LT70-总脂组家兔皮肤结核结节液化进程较一致,并且相比于其它各组较快。BCG组家兔皮肤结核结节在BCG攻击后第3天开始液化,5-7天达液化高峰,时间最早,液化高峰时结节体积达到368.19±78.31mm3,在所有实验组中最大；LT70-总脂组家兔皮肤结核结节液化进程仅次于BCG组,在攻击后第4天开始液化,5-8天达液化高峰,液化高峰时结节体积达到332.77±61.19 mm3。单独总脂组和LT70-中性脂组液化进程居中,单独总脂佐剂组7-10天达液化高峰,LT70-中性脂组10-17天达液化高峰。LT70组和PBS组家兔皮肤结核结节液化进程最慢,达液化高峰时间最晚,分别为第11-15天和第13-17天。结论：本研究表明,分枝杆菌脂质成分具有较强的免疫原性,与亚单位疫苗联合使用时能够增强亚单位疫苗的抗结核免疫保护效果,加速家兔皮肤结核结节发生发展进程。其中,中间极性的脂类强化作用明显,值得深入研究。
【关键词】：结核分枝杆菌 亚单位疫苗 卡介苗 细胞壁 脂质
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-13
• 一. 材料与方法13-34
• 1.1 主要仪器设备13-14
• 1.2 主要实验材料14
• 1.3 实验动物14-15
• 1.4 受试人群15
• 1.5 实验方法15-33
• 1.5.1 BCG培养15-18
• 1.5.2 PPD的制备18-24
• 1.5.3 总脂和各组分脂质的萃取分离与检测24-26
• 1.5.4 各组分脂质在人群PBMCs中免疫反应的检测26-27
• 1.5.5 各组分脂质在人群血清中IgG水平的检测27-29
• 1.5.6 含脂质亚单位疫苗LT70-脂质的制备方法29-30
• 1.5.7 LT70-脂质亚单位疫苗保护效率的评价30-33
• 1.5.7.1 小鼠模型30-32
• 1.5.7.2 家兔皮肤模型32-33
• 1.6 统计学分析方法33-34
• 二、结果34-45
• 2.1 BCG的培养34
• 2.2 PPD的制备34-36
• 2.2.1 PPD的SDS-PAGE电泳34-35
• 2.2.2 测定PPD的浓度35-36
• 2.3 总脂的萃取与TLC检测36-37
• 2.4 总脂和各脂质组分的2D-TLC检测37-38
• 2.5 脂质各组分对结核患者T细胞分泌IFN-γ的水平38
• 2.6 脂质在人群血清中的特异性IgG水平38-39
• 2.7 LT70-总脂、LT70-中间极性脂和LT70-非极性脂的保护效率检测39-45
• 2.7.1 小鼠单独疫苗免疫策略39-40
• 2.7.2 小鼠初免--加强免疫策略40-41
• 2.7.3 家兔皮肤模型41-45
• 讨论45-48
• 结论48-49
• 参考文献49-54
• 攻读硕士学位期间发表的论文和成果54-55
• 致谢55

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5 李s，

本文编号：358637