肺炎链球菌糖代谢蛋白CcpA对荚膜多糖的调控研究

发布时间：2017-05-11 23:12

  本文关键词：肺炎链球菌糖代谢蛋白CcpA对荚膜多糖的调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的肺炎链球菌荚膜(Capsule CPS)是肺炎链球菌的一种重要的毒力因子,在细菌定植、粘附中发挥重要作用,可保护细菌免受宿主的吞噬杀伤作用。肺炎链球菌荚膜合成基因为一操纵子结构,即cps基因座,其表达水平受其上游启动子的调控,但目前尚不清楚有哪些蛋白可通过该启动子调控这些基因及CPS的合成。我们前期研究通过DNA pulldown实验筛选到CcpA可能与肺炎链球菌荚膜多糖(CPS)基因座启动子区域结合,且CcpA(catabolite control protein A, CcpA)是一种与糖代谢相关的转录调控因子,调控了肺炎链球菌多种基因的表达。本研究拟通过EMSA实验验证CcpA与cps启动子序列的结合,并进一步研究其对荚膜的调控作用,为了解肺炎链球菌荚膜合成的分子机制提供新的实验证据。方法利用大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)工程菌原核表达CcpA蛋白,使用Ni2+亲和层析的方法纯化目的蛋白。利用纯化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制备多克隆抗体；采用ELISA法测定抗CcpA抗体效价。随后,利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎链球菌中的保守性。另外,利用EMSA方法分析CcpA与cps基因座启动子区域片段的结合。最后,采用基因重组方法构建ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株；利用ELISA法测定野生D39菌株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回复株的荚膜多糖含量。结果首先得到了高纯度(90%)的CcpA重组蛋白且制备了CcpA多克隆抗体,Western blot结果显示CcpA蛋白在多种血清型的肺炎链球菌均有表达。EMSA实验结果显示,CcpA蛋白可与cps基因座启动子区域结合,且呈剂量依赖性；ccpA基因缺失时,细菌CPS含量升高,回复表达CcpA蛋白后,CPS含量显著降低。结论我们的结果表明,CcpA是肺炎链球菌中一种保守表达的蛋白,可通过与cps基因座启动子特异性结合而负性调控肺炎链球菌荚膜多糖的表达。
【关键词】：肺炎链球菌 ccpA基因 荚膜多糖 转录调控
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-13
• 技术路线13-14
• 第一部分 肺炎链球菌CcpA蛋白的保守性分析以及与CPS基因座启动子区域相互作用的验证14-26
• 1. 实验材料14-16
• 1.1 菌株及质粒14-15
• 1.2 实验动物15
• 1.3 实验试剂15-16
• 1.4 主要仪器16
• 2. 实验方法16-20
• 2.1 ccpA目的基因的PCR扩增17
• 2.2 pET-28a(+)-ccpA重组表达质粒的构建17
• 2.3 重组CcpA蛋白的诱导表达及纯化17-18
• 2.4 多克隆抗体的制备18
• 2.5 ELISA法检测抗血清效价18
• 2.6 Western印迹分析CcpA蛋白保守性18-19
• 2.7 EMSA验证CcpA蛋白与cps启动子序列的结合19-20
• 3. 实验结果20-24
• 3.1 ccpA基因扩增产物的鉴定20-21
• 3.2 pET-28a(+)-ccpA重组质粒的构建21
• 3.3 CcpA重组蛋白的诱导表达及纯化21-22
• 3.4 抗CcpA多克隆抗体的效价分析22
• 3.5 CcpA蛋白保守性表达分析22-23
• 3.6 EMSA验证CcpA蛋白与CPS启动子片段的结合23-24
• 4. 讨论24-26
• 第二部分 肺炎链球菌CcpA蛋白对CPS的调控作用研究26-44
• 1. 实验材料26-29
• 1.1 菌株和质粒26-27
• 1.2 实验试剂27-29
• 1.3 主要仪器29
• 2. 实验方法29-32
• 2.1 ccpA缺失株D39△ccpA的构建与鉴定29-31
• 2.2 ccpA回复株(D39△ccpA：：ccpA)的构建与鉴定31
• 2.3 荚膜多糖含量检测31-32
• 2.4 实时荧光定量PCR32
• 2.5 统计方法32
• 3. 实验结果32-42
• 3.1 ccpA缺失株(D39AccpA)的构建与鉴定32-40
• 3.2 成功构建ccpA回复株(D39AccpA：：ccpA)40
• 3.3 ccpA基因缺失或回复表达后,细菌CPS含量的变化40-42
• 4. 讨论42-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-48
• 文献综述48-56
• 参考文献52-56
• 致谢56-57
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文题录57

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