TALEN技术构建斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除模型的研究

发布时间：2017-05-17 17:17

  本文关键词：TALEN技术构建斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除模型的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 先天性心脏病(CHD)是人类一种非常普遍和具有破坏性的出生缺陷性疾病,其发生与gata4基因突变有关。gata4参与调控心肌细胞中某些特定基因的表达,对心肌细胞的形成、心脏前体细胞的迁移和分化、心瓣膜及间隔发育等具有重要作用。基因敲除技术构建gata4基因敲除的动物模型有助于人类先天性心脏病致病机制和治疗的进一步研究。类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的靶向修饰技术是目前广泛使用的成熟的基因敲除技术,它主要含有两个重要的结构域：特异性识别核酸的靶点识别域和切断DNA序列的核酸酶功能结构域。人工构建针对gata4基因第一外显子的重组核酸酶TALEN,在体内对特定位点产生DNA双链断裂,利用细胞自身DNA损伤后的NHJE引入基因突变、敲除或敲入,实现基因定点修饰的目的,并建立斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除的动物模型。方法 采用生物信息学方法分析斑马鱼gata4基因的编码序列,利用靶位点设计软件选择合适的打靶位点,针对第一外显子设计了一对靶点。使用单元组装法克隆构建特异性TALE靶点结合域,组装完成后通过菌液PCR、测序验证TALE是否组装正确。将TALE靶点结合域克隆到真核表达载体pCS2-PEAS和pCS2-PERR中,得到gata4基因的左、右半位点的重组核酸酶质粒,通过菌液PCR、酶切、测序验证打靶载体是否正确。线性化打靶载体DNA,使用SP6体外转录试剂盒将其转录成mRNAs,通过显微注射的方式注入斑马鱼单细胞期受精卵中,酶切法检测TALEN的体内活性。待注射的斑马鱼性成熟后,通过逐条剪尾、酶切检测发生基因突变的斑马鱼,TA克隆测序确认突变体的基因型,筛选出gata4基因敲除的斑马鱼。结果 菌液PCR、酶切、测序结果均证实成功地构建出了正确的针对gata4第一外显子左、右半位点的重组核酸酶,斑马鱼胚胎体内活性检测发现TALEN的效率为35.18%,通过逐条剪尾、PCR、酶切法检测成功地筛选出了19条gata4基因发生突变的斑马鱼,测序结果显示斑马鱼突变体产生了不同片段大小、不同位置的gata4基因敲除。结论 成功构建gata4基因敲除的斑马鱼模型,为进一步研究人类gata4基因突变引起先天性心脏病的致病机制及治疗研究提供了良好的动物模型。
【关键词】：类转录激活因子效应物核酸酶 斑马鱼 先天性心脏病 gata4基因 动物模型
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.1;R-332
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 前言9-14
• 1、斑马鱼概述9
• 2、斑马鱼胚胎心脏发育概述9-10
• 3、先天性心脏病与gata4基因概述10-11
• 4、TALEN技术11-13
• 4.1 TALEN技术简介11
• 4.2 TALEN技术的原理11-12
• 4.3 TALEN的构建方法12-13
• 4.4 TALEN技术应用13
• 5、CRISPR/CAS9技术13
• 6、本文的研究意义13-14
• 材料和方法14-27
• 实验材料14-16
• 1、实验动物14
• 2、菌种、质粒14
• 3、工具酶14
• 4、试剂盒14
• 5、其他试剂14
• 6、主要仪器及耗材14-15
• 7、主要试剂配制15-16
• 实验方法16-27
• 1、基本方法16-24
• 1.1 斑马鱼gata4基因的提取16
• 1.2 引物设计与合成16-17
• 1.3 PCR扩增目的片段17
• 1.4 电泳检测PCR产物17-18
• 1.5 普通PCR产物纯化18
• 1.6 质粒的提取18-19
• 1.7 质粒的双酶切鉴定19
• 1.8 普通琼脂糖凝胶DNA回收19-20
• 1.9 连接20
• 1.10 氯化钙法制备感受态细胞20-21
• 1.11 转化21
• 1.12 阳性克隆的筛选与鉴定21
• 1.13 体外转录21-22
• 1.14 斑马鱼饲养及繁殖22-23
• 1.14.1 斑马鱼的饲养环境22
• 1.14.2 斑马鱼饲料22-23
• 1.14.3 斑马鱼的雌雄鉴别23
• 1.14.4 受精产卵23
• 1.14.5 胚胎孵化23
• 1.14.6 幼鱼的培育23
• 1.15 显微注射23-24
• 1.16 测序24
• 2、TALEN实验流程24-27
• 2.1 敲除靶点的选择与确认24-25
• 2.2 采用“单元组装法”构建pMD-TALE载体25
• 2.3 构建TALEN表达终载体25-26
• 2.4 TALENs质粒体外转录26
• 2.5 TALEN体内活性检测26
• 2.6 斑马鱼gata4敲除动物模型检测26-27
• 结果与分析27-38
• 1、斑马鱼gata4基因的靶点分析结果27
• 2、gata4基因扩增与敲除靶点比对27-28
• 3、“单元组装法”构建pMD-TALE载体28-32
• 3.1 左半位点(pMD-TALE-L)、右半位点(pMD-TALE-R)构建方案28-29
• 3.2 左半位点(pMD-TALE-L)、右半位点(pMD-TALE-R)构建过程29-32
• 4、pCS2-PEAS-L和pCS2-PERR-R终载体的构建与鉴定32-33
• 5、TALEN体内活性检测33-35
• 6、斑马鱼gata4敲除动物模型检测35-38
• 6.1 酶切法检测TALEN敲除效率35-36
• 6.2 F_0代基因型检测36
• 6.3 斑马鱼胚胎心脏结构观察及心率的测量36-38
• 讨论38-41
• 结论41-42
• 参考文献42-46
• 附录1：综述46-55
• 参考文献50-55
• 附录2：中英文缩略词表55-57
• 附录3：所用载体信息57-58
• 附录4：测序结果58-59
• 附录5：个人简介59-60
• 致谢60-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 陈宝增;李凤超;康现江;;实验室斑马鱼的繁育与养殖技术[J];河北渔业;2008年04期

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3 ;Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J];遗传学报;2012年05期

4 肖安;胡莹莹;王唯晔;杨志們;王展翔;黄鹏;佟向军;张博;林硕;;人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术[J];遗传;2011年07期

5 沈延;肖安;黄鹏;王唯晔;朱作言;张博;;类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术[J];遗传;2013年04期

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本文编号：374032