可溶性重组人精囊蛋白1片段的原核表达及其对精子活力的影响

发布时间：2017-05-17 17:01

  本文关键词：可溶性重组人精囊蛋白1片段的原核表达及其对精子活力的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来,国内外针对男性避孕疫苗的研究取得了突出的进展,主要集中于:(1)几种非常有潜能的重要蛋白被发现,包括Eppin,FSHR,Izumo,CRISP-1,Cat Sper1等[1-5];(2)佐剂及免疫诱导等方面更成熟。这些为研制高效、可逆性避孕疫苗提供了重要的前提条件。然而,由于天然自身抗原的抗原性弱,且缺乏蛋白质晶体结构的解析,严重制约了对其关键功能域的改造研究,迄今仍无理想的避孕疫苗问世。人精囊蛋白属于快速进化类蛋白,在人体多个组织中都有表达,包括肿瘤组织。人精囊蛋白可以分为两种类型,即精囊蛋白I(semenogelin I,SEMG1)和精囊蛋白Ⅱ(semenogelin II,SEMG2)。在射精时,精囊蛋白与精液混合,形成精液凝胶,抑制精子向前运动。目前的研究表明:在机体内,金属离子与蛋白质的结合对控制诸如记忆、学习等生理过程发挥重要的调节作用,精囊蛋白亦是如此。锌离子与精囊蛋白结合后,通过改变蛋白的三级结构,从而控制精囊蛋白相关作用的发挥。除此以外,精子细胞膜表面的钙离子泵,目前认为与精子活力的变化息息相关。精囊蛋白必须通过与精子尾部表面Eppin蛋白相结合,再与丛生蛋白、乳铁蛋白形成一种称为EPC的复合物,从而发挥其生物学活性。将重组Eppin蛋白主动免疫雄性猿猴后,可以检测到特异性抗Eppin抗体,且免疫后78%雄性不育。抗Eppin抗体的结构与SEMG结构非常相似。因此,本研究认为,通过研究SEMG1蛋白结构及其与Eppin相互作用位点,可能为新型免疫避孕疫苗的研究提供依据。本课题计划通过原核表达足量可溶性重组蛋白,为下一阶段蛋白质结晶与晶体结构解析做准备,进而为候选疫苗研究提供条件。本课题分为以下三个部分:第一部分:SEMG1与△SEMG1蛋白质氨基酸序列分析,运用计算机软件对蛋白氨基酸序列及二级结构进行分析、比较;第二部分:构建△SEMG1可溶性蛋白质的原核表达体系,探寻重组蛋白最佳表达载体,大量表达的最优诱导条件以及纯化方式等;第三部分:纯化后的重组蛋白的功能验证。结果:1、△SEMG1蛋白质二级结构中共有5个α-螺旋,4个β-折叠片,且分布不规则;△SEMG1蛋白片段具有较强的抗原性与亲水性;△SEMG1结构分析表明相对SEMG1更适合用于重组目的蛋白表达;2、从多种原核表达载体及工程菌中(包括带有sumo标签质粒、pet-28b质粒、ROSETTA等)中经优化改良,最终获得可溶性重组蛋白;3、经反复尝试,最终获得了结合Amylose层析柱、TEV酶过夜酶切、目的蛋白Ni柱纯化以及分子筛纯化相结合的纯化方式,并获得高纯度、可溶性目的蛋白;4、纯化后的△SEMG1重组蛋白经Western blot验证为与理论分子量大小一致的蛋白质,且经质谱分析证实为△SEMG1;5、纯化后的△SEMG1重组蛋白对精子活力有明显的抑制效应。综上所述,本研究通过分析SEMG1蛋白质氨基酸序列及其二级结构特点,确定其165~281aa,即△SEMG1为研究目标;在p Mal-c2x-TEV载体上成功地插入△SEMG1基因片段,构建了可表达可溶性△SEMG1重组蛋白的重组质粒;并进一步探索出目的蛋白的纯化方法及其最佳纯化条件;验证实验显示可溶性的△SEMG1重组蛋白具有显著地抑制精子活力的作用。本研究是首次在原核表达系统下获得的可溶性的△SEMG1蛋白,为后续功能研究、结构分析以及非甾体类避孕疫苗的研究打下了坚实的基础。
【关键词】：精囊蛋白 原核表达 可溶性蛋白 精子活力 避孕
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略词语表4-6
• 英文摘要6-8
• 中文摘要8-10
• 前言10-13
• 第一章 SEMG1与△SEMG1的序列分析13-21
• 1.1 实验方法13-15
• 1.2 结果15-20
• 1.3 讨论20-21
• 第二章 可溶性△SEMG1重组蛋白的原核表达与纯化21-46
• 2.1 材料与方法21-37
• 2.2 结果37-44
• 2.3 讨论44-46
• 第三章 重组△SEMG1蛋白的功能实验46-51
• 3.1 材料与方法46-48
• 3.2 结果48-49
• 3.3 讨论49-51
• 全文总结51-52
• 参考文献52-56
• 文献综述 人精囊蛋白1的研究进展56-66
• 参考文献62-66
• 硕士期间发表论文的情况66-67
• 致谢67

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