日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶抗原表位与霍乱毒素B亚基融合蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞的表达

发布时间：2023-03-04 21:17

　　PCR扩增日本血吸虫28 000谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)的主要抗原表位与霍乱毒素B亚基(CTB)的融合基因, CTB-Sj28GST经SalⅠ和SphⅠ双酶切后定向克隆至转移质粒pFastBac,构建重组转移质粒pFastBac-CTB-Sj28GST,转化DH10Bac感受态细胞进行基因的同源重组,提取重组病毒,用M13通用引物以及CTB-Sj28GST引物PCR鉴定阳性后转染草地贪夜蛾细胞(Sf9),收集亲代重组病毒反复感染Sf9细胞进行病毒扩增, PCR鉴定重组病毒。重组病毒感染细胞出现病变时,用抗Sj28GST多克隆抗体间接免疫荧光(IFA)鉴定重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定病毒感染细胞裂解液,分析重组蛋白的抗原性。研究结果表明, Sj28GST含有4个抗原表位,长189 bp,与CTB融合后长519 bp。重组转移质粒pFastBac-CTB-Sj28GST的PCR及序列鉴定与预期一致。Sf9转染细胞获得的重组病毒经PCR鉴定,获得与预期一致的519 bp片段。IFA鉴定表明,重组病毒感染的Sf9细胞呈现绿色荧光,未感染的...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞株、载体和菌株
    1.2 主要试剂
    1.3 引物设计
    1.4CTB-Sj28GST的PCR扩增和pFastBac-CTB-Sj28GST重组转移质粒构建
    1.5 Bacmid-CTB-Sj28GST重组穿梭质粒的构建和鉴定
    1.6 重组病毒的转染及病毒DNA的提取鉴定
    1.7 Sf9昆虫细胞表达重组蛋白鉴定
        1.7.1 重组蛋白的间接免疫荧光鉴定
        1.7.2 重组蛋白的Western blotting鉴定
    1.8 伦理批准患者知情同意
2 结果
    2.1 p FastBac-CTB-Sj28GST重组转移质粒的鉴定
    2.2 Bacmid-CTB-Sj28GST重组穿梭质粒的鉴定
    2.3 重组杆状病毒的DNA鉴定
        2.4.1 Sf9细胞感染后变化
        2.4.2 表达蛋白的IFA检测
        2.4.3 表达蛋白的Western blotting鉴定
3 讨论



本文编号：3755016