长期低剂量镉致正常肝脏细胞异常增殖及其与caspase-8甲基化的关系

发布时间：2017-05-20 08:01

  本文关键词：长期低剂量镉致正常肝脏细胞异常增殖及其与caspase-8甲基化的关系，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的] 应用L-02细胞建立长期低剂量镉转化细胞模型。观察转化细胞形态学变化，检测转化细胞增殖，凋亡和甲基化的改变，探讨长期低剂量镉导致细胞转化的机制。 [方法] 1）镉转化细胞模型的建立与鉴定。MTT法确定镉培养的浓度，形态学分析和WesternBlot确定镉培养的时间；台盼蓝染色计数法和细胞克隆形成检测转化细胞的增殖率，倍增时间和克隆形成率；Transwell检测转化细胞的迁移侵袭能力；流式细胞术检测转化细胞的周期，ROS水平和凋亡率的变化。 2）转化细胞相关实验。实验分组：对照组（正常L-02细胞），CDT-L-02组（镉转化细胞），5-aza组（正常L-02细胞加5-aza处理），CDT-L-02+5-aza组（镉转化细胞加5-aza处理）。台盼蓝染色计数法检测各组细胞的增殖率；流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化；WesternBlot检测各组细胞DNMTs，凋亡和周期相关蛋白以及PCNA表达的变化；限制性内切酶酶切电泳和MSP检测各组细胞基因组DNA甲基化和caspase-8基因启动子甲基化的水平。 3）癌细胞相关实验。实验分组：对照组（正常L-02细胞），CDT-L-02组（镉转化细胞），HepG-2组（肝癌细胞），HepG-2+5-aza组（肝癌细胞加5-aza处理）。台盼蓝染色计数法检测甲基化抑制剂5-aza处理后肝癌细胞HepG-2活性；MSP检测5-aza处理后肝癌细胞HepG-2caspase-8启动子甲基化的水平；WesternBlot检测5-aza处理后肝癌细胞HepG-2DNMT1，caspase-8的表达。 [结果] 1）1μM氯化镉培养L-02细胞第2周时，细胞形态开始发生变化，，细胞长轴逐渐变长；10周时，细胞从方形变成长梭形，与正常对照组相比，转化细胞DNMT1表达稳定升高，Caspase-8表达稳定下降，p＜0.05。与正常对照组L-02细胞相比，转化细胞的增殖率，克隆形成率和迁移侵袭能力明显升高，p＜0.05，但是ROS的产生，倍增时间和凋亡率明显减少，p＜0.05。 2）转化细胞在甲基化抑制剂5-aza的作用下，与正常对照组相比，升高的增殖率明显下降，减少的凋亡率明显增加，p＜0.05；DNMTs，Caspase-8与其他凋亡和周期相关蛋白的表达在5-aza的作用下恢复到正常对照组的水平，p＜0.05；基因组和caspase-8基因启动子甲基化的水平也有所恢复。 3）5-aza作用48h，与HepG-2组相比HepG-2+5-aza组的细胞活性明显下降，p＜0.05； DNMT1表达减少，Caspase-8表达增加，p＜0.05；与正常L-02细胞相比，肝癌细胞HepG-2caspase-8基因启动子甲基化水平较高，5-aza的作用使肝癌细胞HepG-2caspase-8基因启动子甲基化水平下降。 [结论] 1.长期低剂量镉能促进正常肝细胞L-02增殖增加，凋亡减少，并改变细胞的形态，导致正常细胞发生转化。 2.长期低剂量镉导致细胞转化的机制是其提高了基因组DNA和caspase-8基因启动子甲基化的水平；肝癌细胞的恶性增殖也与caspase-8基因启动子异常甲基化有关。
【关键词】：长期低剂量镉 转化 甲基化 caspase-8 增殖 凋亡
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 前言5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-14
• 英文缩写词表14-15
• 第1章 文献综述15-23
• 1.1 镉的毒性15-16
• 1.2 镉的致癌性16-17
• 1.3 镉与细胞增殖17-18
• 1.4 镉与凋亡18-20
• 1.5 镉与 DNA 甲基化20-23
• 1.5.1 高甲基化20-21
• 1.5.2 低甲基化21-23
• 第2章 材料与方法23-33
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 实验细胞23
• 2.1.2 主要仪器与设备23-24
• 2.1.3 实验试剂24-25
• 2.2 实验方法25-33
• 2.2.1 细胞培养25-26
• 2.2.2 MTT 确定长期培养 L-02 的氯化镉浓度26
• 2.2.3 细胞形态学分析26
• 2.2.4 Transwell 检测细胞迁移侵袭能力26-27
• 2.2.5 细胞克隆形成实验27
• 2.2.6 台盼蓝染色检测细胞增殖率，倍增时间和细胞活力27-28
• 2.2.7 流式细胞术检测细胞内 ROS 水平28
• 2.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡率28
• 2.2.9 WB 检测蛋白表达28-30
• 2.2.10 限制性内切酶酶切电泳法检测基因组 DNA 甲基化水平30-31
• 2.2.11 MSP（甲基化特异性 PCR）31-32
• 2.2.12 统计学分析32-33
• 第3章 结果33-48
• 3.1 镉与人正常肝细胞 L-0233-45
• 3.1.1 MTT 确定镉作用浓度33-34
• 3.1.2 根据细胞形态和蛋白表达变化确定镉作用时间34-35
• 3.1.3 转化细胞增殖能力和 ROS 的变化35-38
• 3.1.4 转化细胞基因组甲基化水平的变化38
• 3.1.5 5-aza 对转化细胞蛋白表达，凋亡，增殖能力的影响38-43
• 3.1.6 5-aza 对 caspase-8 基因启动子甲基化的影响43-45
• 3.2 DNA 甲基化与肝癌细胞 HepG-245-48
• 3.2.1 5-aza 对肝癌细胞 caspase-8 基因启动子甲基化的影响45-46
• 3.2.2 5-aza 对肝癌细胞蛋白表达和细胞活性的影响46-48
• 第4章 讨论48-52
• 第5章 结论52-53
• 参考文献53-66
• 在读期间所取得的科研成果66-67
• 获奖经历67-68
• 致谢68-69

【共引文献】

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