CHO细胞表达的人透明质酸酶结构与功能研究

发布时间：2017-05-20 11:22

  本文关键词：CHO细胞表达的人透明质酸酶结构与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的:随着当代生物技术的迅速发展,抗体药物的应用越来越广泛,由于其用药剂量大,静脉注射给药成为了主要给药方式,这给患者带来了很多不便。研究发现皮下注射给药能够降低抗体给药时间和相关花费,然而也带来了新的挑战,比如给药体积的限制。随着研究的进展,r Hu PH20的开发使得皮下给药成为了可能,它能够通过降解皮下细胞间质的透明质酸来暂时增大皮下给药空间从而增加给药体积。本研究首先对r Hu PH20进行了CHO细胞真核表达,随后我们通过高效液相与质谱串联对r Hu PH20的结构从不同水平上进行表征鉴定,并对唾液酸含量进行了测定,然后对其体内、体外生物学功能进行了进一步分析,最后将其应用在抗PD-L1抗体的制剂开发中并初步评估了该抗体的药代动力学。本研究首次详细鉴定了r Hu PH20的糖型结构及位点并为其将来的临床应用打下坚实的基础。研究方法:nSDS-PAGE测定r Hu PH20的表观分子量。nLC/MS分析r Hu PH20完整蛋白图谱,确定其准确分子量。nLC/MS对r Hu PH20质量肽图谱进行分析,对其糖基化位点进行确认。nLC/MS对r Hu PH20游离寡糖类型进行鉴定,并对各糖型进行相对定量。n体外通过浊度法测定r Hu PH20的体外活性。n体内通过细胞间隙扩散实验(台盼蓝法)测定r Hu PH20的活性,开发抗PD-L1抗体皮下注射制剂及测定该抗体的体内药代动力学。研究结果:?SDS-PAGE分析,r Hu PH20分子量与理论分子量基本保持一致。?PNGase F糖苷酶酶切后测得的r Hu PH20主峰的精确分子量为52261.75 Da。?LC-MS在质量肽图谱分析,鉴定出六个r Hu PH20 N糖基化位点,分别位于第47、131、200、219、333、358位的Asn。?LC-MS在游离寡糖的分析,共确认18种糖型,主要以二天线寡糖为主,并且还含有较多高甘露糖。?体内外功能分析结果显示,r Hu PH20都有较好的活性,并能够较好促进抗PD-L1抗体的吸收,但在PNGase F酶切去除N糖基化修饰后活性显著降低。
【关键词】：重组人透明质酸酶 糖基化 质量肽图谱 液质联用 生物活性 药代动力学
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-12
• 第一部分 rHuPH20的构建、表达与鉴定12-17
• 一、实验材料12-13
• 二、实验方法13-15
• 三、实验结果15-16
• 四、讨论16-17
• 第二部分 rHuPH20结构深度表征17-51
• 一、完整蛋白水平上一级结构及修饰确认17-22
• 二、质量肽图谱水平上糖基化修饰确认22-37
• 三、游离寡糖的分析37-46
• 四、唾液酸含量的测定46-51
• 第三部分 rHuPH20生物活性测定51-59
• 一、rHuPH20体外活性的测定51-56
• 二、rHuPH20体内活性的测定56-59
• 第四部分 抗PD-L1抗体rHuPH20混合制剂药代评估59-69
• 一、实验材料59-60
• 二、实验方法60-63
• 三、实验结果63-68
• 四、讨论68-69
• 结论69-70
• 参考文献70-74
• 综述：透明质酸酶的研究进展74-90
• 参考文献82-90
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明90-91
• 致谢91

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