毕赤酵母中人RANK胞外段的表达纯化及其阻断作用的研究

发布时间：2017-05-22 20:07

  本文关键词：毕赤酵母中人RANK胞外段的表达纯化及其阻断作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：NF-κB的受体活化因子配体/受体(RANKL/RANK)信号介导破骨细胞形成和骨吸收。此外,此信号还可以影响其他生物学过程,包括免疫系统和癌症。RANKL/RANK信号在淋巴结发育、淋巴细胞分化、树突状细胞存活、T细胞活化和免疫耐受诱导中均扮演着重要角色。因此,抑制RANKL为阻止骨疾病、癌症病人的骨转移、骨免疫相关疾病、打破中枢免疫耐受促进抗肿瘤免疫应答T细胞的发生等提供一个新的思路与治疗手段。本研究首先对人RANK胞外段序列进行毕赤酵母表达系统的密码子优化,然后克隆到pPIC9K酵母表达载体中,将重组质粒电转化到毕赤酵母,筛选获得高表达RANK胞外段蛋白(RANK-N)的菌株。我们通过SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色和Western Blot鉴定,证实所构建表达菌株及目的蛋白的正确性。经过摇瓶表达的超滤、Sephadex G-50凝胶过滤层析和Q Sepharose FF离子交换层析三个步骤纯化重组蛋白,获得了纯度在95%以上的目的蛋白。利用等离子共振(SPR)技术分析重组RANK蛋白与RANKL蛋白之间的亲和力,进而证实了重组RANK-N能结合RANKL。通过一系列体外体内实验发现重组RANK-N蛋白能够阻断RANKL激活的RANK信号。此外,我们利用人结直肠癌小鼠移植瘤模型(patient derived xenograft,PDX)发现RANK胞外段蛋白可以抑制人结肠癌的生长。通过此项研究,我们建立了一个简单有效、可线性放大的RANK-N表达纯化系统,为最终的大规模生产及成果转化奠定了基础。
【关键词】：RANK 毕赤酵母 蛋白纯化 骨疾病 结肠癌
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;R363
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 缩略词索引7-8
• 1.引言8-19
• 1.1 RANK8-10
• 1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统10-11
• 1.3 RANK/RANK/OPG简介11-18
• 1.4 研究目的18-19
• 2.材料和方法19-40
• 2.1 材料19-25
• 2.2 方法25-40
• 3.结果40-50
• 3.1 克隆RANK胞外端基因40-41
• 3.2 筛选获得毕赤酵母较高表达菌株41-42
• 3.3 RANK-N表达菌株蛋白摇瓶表达、纯化和糖基化鉴定42-46
• 3.4 RANK-N的体外功能46-49
• 3.5 RANK-N的体内功能49-50
• 4.讨论和结论50-54
• 参考文献54-62
• 致谢62-64
• 攻读学位期间发表的学术论文目录64-65
• 综述65-73
• 参考文献70-73

【共引文献】

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1 孙衍昶;郭t$t$;赛克;王翦;王洁;陈芙蓉;张宗平;陈忠平;;MicroRNA-181b提高U87细胞对VM-26的敏感性研究[J];中国神经肿瘤杂志;2013年02期

2 汪章勋;周权;孟慧敏;张军;黄勃;;金龟子绿僵菌MicroRNA在蝉蜕和蚕血淋巴诱导下的差异表达分析[J];安徽科技学院学报;2013年05期

3 Wenwen Jia;Wen Chen;Jiuhong Kang;;The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

4 安丽娜;董斐斐;王国坤;单冬凯;荆清;;MicroRNA与动脉粥样硬化[J];国际心血管病杂志;2013年04期

5 冯楠楠;孙品;夏昭林;;凋亡相关的microRNA分子研究进展[J];工业卫生与职业病;2013年05期

6 陈娟娟;艾剑刚;黄世峰;曹炬;张莉萍;;HBx介导miR-221上调-ERα下调致HepG2细胞恶性增殖[J];第三军医大学学报;2013年20期

7 张世芳;魏彩虹;陆健;张小宁;周鑫磊;张淑珍;王光凯;曹家雪;赵福平;张莉;杜立新;;深度测序鉴定绵羊microRNA转录组[J];中国畜牧兽医;2013年09期

8 张义;李龙;岳信;田夫;;miRNA与肿瘤的研究进展[J];长江大学学报(自科版);2013年36期

9 Juan Liu;Chang-Ping Wu;Bin-Feng Lu;Jing-Ting Jiang;;Mechanism of T cell regulation by microRNAs[J];Cancer Biology & Medicine;2013年03期

10 谢杏仪;黎毓光;韩泽平;吕钰冰;陈顺仪;何金花;;Hsa-miR-203联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞的作用[J];安徽医药;2013年10期

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1 Ruiwen Fan;Shanshan Yang;Zhanquan Shi;Kaiyuan Ji;Xiaoyun Jia;Jianbo Yao;George W Smith;Changsheng Dong;;Identification of a novel miRNA important for melanogenesis in alpaca(Lama Pacos)[A];2013中国驼业进展[C];2013年

2 曾清华;周箐;康秀华;;血清microRNA的检测及在肺癌诊断中应用的进展[A];江西省第二次中西医结合呼吸疾病学术会议论文集[C];2012年

3 秦燕;张玲云;张德玖;;核糖体展示技术在非编码核酸研究中的应用[A];生命科学——专题：RNA研究的新技术和新方法（第26卷第3期）[C];2014年

4 李文峰;钟伯雄;苏松坤;;蜜蜂级型分化机理[A];2014年全国蜂产品市场信息交流会暨中国（哈尔滨）蜂业博览会论文集[C];2014年

5 宋毅;谢延风;张铃铛;冯清林;刘明冬;张鹏;范仕兵;杜江峰;;MiRNA在垂体泌乳素腺瘤中表达的初步研究[A];全国高血压防治知识推广培训班暨健康血压中国行海南海口会论文综合刊[C];2014年

6 陈轶;陈益耀;蔡曼妮;巫华志;;非酒精性脂肪性肝病患者血清miR-29b水平变化及临床意义[A];中国转化医学和整合医学研讨会论文综合刊[C];2015年

7 Junli Guo;Shaoping Zheng;Zhihong Weng;Keping Xie;Shaojiang Zheng;;Molecular Biomarkers of Pancreatic Intraepithelial Neoplasias and Implications in Early Diagnosis and Therapeutic Intervention[A];第七届生命科学联合学术大会论文汇编[C];2015年

8 Shaosheng Wang;Xiaohong Zhao;Jie Wang;Yingmei Wen;LinJing Zhang;Dezhu Wang;Huili Chen;Qiuxia Chen;Wei Xiang;;Upregulation of micro RNA-203 is associated with advanced tumor progression and poorprognosis in epithelial ovarian cancer[A];第七届生命科学联合学术大会论文汇编[C];2015年

9 邱小宇;黄勇富;娜日苏;俄广鑫;陈李鹏;;山羊卵巢miRNAs的克隆、测序及表达鉴定[A];2015年全国养羊生产与学术研讨会论文集[C];2015年

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2 邵耘;MicroRNA-101与环氧化酶-2在胃癌组织中的表达及意义[D];南京医科大学;2013年

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本文编号：386724