鸟分枝杆菌耐受活性氮和活性氧基因的筛选及功能研究

发布时间：2017-05-22 14:25

  本文关键词：鸟分枝杆菌耐受活性氮和活性氧基因的筛选及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：鸟分枝杆菌是细胞内寄生菌,在艾滋病晚期常可发生鸟分枝杆菌的扩散性感染。巨噬细胞作为分枝杆菌的宿主细胞,其内微环境包含有多种杀(抑)菌机制,比如酸、活性氧(ROS,如02、H2O2)和活性氮(RNS,如NO、NO2)、多种溶菌酶、抗菌肽等。这些机制的存在,理论上可以有效的抑制进入巨噬细胞的病原细菌。但是,某些病原细菌在感染早期显然能够耐受这些杀(抑)菌机制,在巨噬细胞内大量繁殖,为后续全身性的胞外感染奠定基础。本文通过构建鸟分枝杆菌基因组文库,筛选耐受活性氮和活性氧相关基因,以探讨鸟分枝杆菌适应巨噬细胞的杀(抑)菌机制,为深入研究鸟分枝杆菌的致病机理给出新的线索,进而为新药物的开发提供可能的靶点。方法： (1)利用CTAB法提取鸟分枝杆菌基因组DNA,用Sau3A Ⅰ部分酶切后与用BamH Ⅰ酶切并经磷酸化处理的pUC19质粒连接,转化大肠杆菌JM109,构建鸟分枝杆菌基因组文库；(2)利用生物活性水平筛选方法,通过含有NaNO2的培养液,从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选耐受活性氮的克隆子；(3)对所得的克隆子进行测序以获取插入片段的序列,通过生物信息学分析获取插入序列的信息和目的基因；(4)根据目的基因的开放阅读框架设计引物,利用PCR扩增目的基因,与相应的表达载体连接后构建重组表达质粒；(5)重组表达质粒在大肠杆菌诱导表达及表达产物的SDS-PAGE检测；(6)分别以NaNO2、GSNO、H2O2、SDS作为胁迫,通过计算平板菌落数(CFU)或测定吸光度值,分析重组目的基因的耐受性。(7)利用生物信息学对目的基因编码蛋白的理化性质、空间结构和功能位点进行预测分析。结果：构建的鸟分枝杆菌基因组文库滴度为8×103cfu/ml,随机挑选10个克隆进行BamH I酶切分析,可见插入片段大小约在100-750bp之间,基本达到文库建立的要求。通过含有NaNO2的培养液,从构建的鸟分枝杆菌基因组文库中筛选到一个耐受活性氮的克隆子,测序结果分析表明,该克隆子的插入序列有两个读码框,一个编码目的基因(取名为noA),另一个编码P49蛋白基因,分别处在插入序列的两条链上。构建noA重组表达质粒做NaNO2、GSNO、H2O2、SDS胁迫试验,结果显示noA耐受NaNO2、 GSNO2、H2O2的能力明显高于对照,而其耐受SDS的能力与对照没有显著性差异。结论：从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选到一个能抵抗NaNO2、 H2O2胁迫的基因-noA,这是一个新型的耐受活性氧和活性氮基因。从预测的理化性质、功能位点及结构特点推断,noA蛋白有可能成为诊断、治疗或者预防鸟分枝杆菌病的有价值的靶分子。
【关键词】：鸟分枝杆菌 基因组文库 耐受 ROS RNS noA
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 个人简历3-7
• 英文缩略语表7-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-16
• 第一章 鸟分枝杆菌基因组文库的构建16-26
• 1 材料与仪器16-17
• 1.1 实验材料16
• 1.2 主要仪器设备16
• 1.3 主要试剂配置16-17
• 2 实验方法17-21
• 2.1 JM109感受态细胞的制备(CaCl_2法)17-18
• 2.2 感受态细胞转化率检测18
• 2.3 鸟分枝杆菌基因组DNA制备(CTAB抽提法)18-19
• 2.4 pUC19质粒去磷酸化处理19-20
• 2.5 基因组DNA部分酶切20
• 2.6 连接与转化20-21
• 2.7 文库鉴定21
• 3 实验结果21-23
• 3.1 E.coli JM109感受态细胞转化率检测21
• 3.2 基因组DNA提取结果21
• 3.3 pUC19质粒去磷酸化处理和基因组部分酶切21-23
• 3.4 文库构建及质量检测23
• 4 分析与讨论23-26
• 第二章 耐受活性氮基因的筛选26-32
• 1 材料与仪器26
• 1.1 实验材料26
• 1.2 主要仪器设备26
• 1.3 主要试剂配制26
• 2 实验方法26-27
• 2.1 文库的筛选26-27
• 2.2 测序及序列初步分析[33]27
• 3 实验结果27-30
• 3.1 基因组文库的筛选及目的克隆的获得27
• 3.2 序列分析结果27-30
• 4 分析与讨论30-32
• 第三章 MAC-noA耐受活性氮和活性氧的功能研究32-45
• 1 材料与仪器32-33
• 1.1 实验材料32
• 1.2 主要仪器设备32
• 1.3 主要试剂配制32-33
• 2 实验方法33-37
• 2.1 MAC-noA引物设计及扩增33-34
• 2.2 pUC19-noA重组载体构建34
• 2.3 pGEX-noA和pET-noA重组表达载体的构建34
• 2.4 原核表达及检测34-36
• 2.5 MAC-noA耐受活性氮和活性氧的功能研究36-37
• 3 实验结果37-42
• 3.1 PCR扩增和重组载体构建37
• 3.2 耐受活性氮和活性氧的功能研究结果37-42
• 4 分析与讨论42-45
• 第四章 MAC-noA编码蛋白生物信息学分析45-52
• 1 分析方法45
• 2 结果与分析讨论45-52
• 2.1 理化性质分析45-48
• 2.2 二级结构分析48
• 2.3 功能位点分析48
• 2.4 同源性分析与进化树的建立48-51
• 2.5 同源建模51-52
• 总结52-54
• 参考文献54-59
• 综述59-77
• 参考文献70-77
• 附件77-78
• 致谢78-79
• 攻读学位期间发表的学术论文目录79

【参考文献】

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1 陈q，

本文编号：385982