CaV1.1-R528H突变小鼠甲亢性低钾型周期性麻痹模型的建立及其机制的研究

发布时间：2017-05-23 07:16

  本文关键词：CaV1.1-R528H突变小鼠甲亢性低钾型周期性麻痹模型的建立及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的低钾型周期性麻痹(hypokalemic periodic paralysis,简称HPP)主要分为散发型低钾型周期性麻痹(sporadical hypokalemic periodic paralysis,SHPP)、家族性低钾型周期性麻痹(familial hypokalemic periodic paralysis,简称FHPP)和甲亢性低钾型周期性麻痹(thyrotoxic hypokalemic periodic paralysis,简称TPP)。家族性低钾型周期性麻痹是一种与骨骼肌电压门控L-型钙通道和钠通道异常有关的常染色体显性遗传病,主要涉及的突变基因有CACNA1S、SCN4A和KCNE3,其中CACNA1S基因突变是最常见的。在甲亢性低钾型周期性麻痹中,也发现了相关离子通道基因的突变,如KCNE3、KCNE4基因以及Kir2.6的突变,但除个别报道外,数量极少,阳性率不足1%,但也说明TPP是有离子通道疾病的特点。因此,已发现的低钾型周期性麻痹相关突变可以作为甲亢性低钾型周期性麻痹发病机制研究的借鉴与补充。目前对于离子通道的突变如何导致HPP或TPP的发病,还不是十分清楚,国内外对HPP的相关研究也仅局限于细胞水平及离子通道的电生理改变。前期课题组选择代表性好、发病症状重的Ca V1.1-Arg528His(R528H)突变,运用同源重组和胚胎干细胞技术成功的构建了Ca V1.1-R528H突变小鼠模型。然而在我国,低钾型周期性麻痹主要以甲亢性低钾型周期性麻痹为主。为了方便研究TPP发病机制,我们利用课题组前期构建的钙离子通道缺陷型Ca V1.1-R528H突变小鼠进一步建立甲亢性低钾型周期性麻痹模型并对其相关机制进行研究,期望能从整体动物水平探索相关发病机制,为临床提供更好的诊疗依据。方法部分1 Ca V1.1-R528H突变小鼠鉴定:实验前随机抽取8只Ca V1.1-R528H突变小鼠,提取鼠尾基因组DNA进行PCR鉴定,并在8只小鼠基因组DNA的PCR产物中随机选取5只进行DNA测序。部分2 Ca V1.1-R528H突变小鼠与野生型C57BL/6J小鼠生化指标比较:实验前取8周龄Ca V1.1-R528H突变小鼠雌雄各8只以及8周龄野生型C57BL/6J小鼠雌雄各8只。所有小鼠于当日20:00开始禁食、禁水,次日早晨8:00摘取眼球取血于EP管中送检,检测生化指标包括葡萄糖(GLU)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、血肌酐(Cr)、电解质(Na~+、K~+、Cl-)8项指标。部分3探讨突变、甲状腺素及胰岛素因素对血钾的作用:取8周龄Ca V1.1-R528H突变雄性小鼠及8周龄野生型C57BL/6J雄性小鼠各36只,采用三因素两水平2×2×2析因设计方法,按体重随机原则分为8组,甲状腺素处理组每日腹腔注射左旋甲状腺素钠(按350μg/kg),连续给药12天,制备高甲状腺素毒症,同时其余组给予注射0.9%生理盐水作为对照。末次给药后胰岛素处理组给予腹腔注射短效胰岛素(按0.8U/kg),同时其余组给予0.9%生理盐水作为对照,检测并记录注射前(0min)及注射后各时间点(30mim、60min)的血钾。部分4 FXYD1蛋白在甲亢性低钾型周期性麻痹致病中的作用:小鼠(野生+盐水组、突变+盐水组、突变+甲状腺素+盐水组、突变+甲状腺素+胰岛素组)测完血钾后将其处死,立即取后肢股四头肌,大小约1cm×0.5cm×0.2cm,并快速放入10%中性福尔马林溶液中固定,固定24h后石蜡包埋。4μm连续切片,于65℃温箱烘干,常温保存备用。采用免疫组织化学技术对各组小鼠骨骼肌细胞FXYD1蛋白进行染色,并比较组间表达是否存在差异。结果部分1 Ca V1.1-R528H突变小鼠鉴定:PCR和DNA测序结果验证了该小鼠为Ca V1.1-R528H突变纯合小鼠,DNA扩增片段长度为870bp,而野生对照组为748bp。部分2 CaV1.1-R528H突变小鼠与野生型C57BL/6J小鼠生化指标比较:基因敲入Ca V1.1-R528H突变小鼠与野生型C57BL/6J小鼠同性别之间比较,结果无统计学差异(P0.05);基因敲入Ca V1.1-R528H小鼠雌、雄之间比较及野生型C57BL/6J小鼠雌、雄之间比较,结果均无统计学差异(P0.05)。部分3突变、甲状腺素及胰岛素因素对血钾的作用:(1)高甲状腺素毒症状态:甲状腺素处理组小鼠出现烦躁不安、易激怒及毛色枯燥等现象,相比对照组饮食及饮水量明显增多,而体重增加缓慢。T3、T4及TSH检测结果示Ca V1.1-R528H突变小鼠与C57BL/6J小鼠之间并无统计学上差异,而注射左旋甲状腺素钠组小鼠T3、T4均高于相应对照组,TSH低于相应对照组,且均有统计学差异(P0.05)。(2)胰岛素对血钾作用:单独给予甲状腺素或胰岛素处理,突变组与野生组血钾同时间点比较并没有统计学差异,而在高甲状腺素毒症状态下给予胰岛素处理后,突变组与野生组同时间点(30min、60min)比较突变组血钾显著低于野生组(P0.05)。(3)单独突变因素或甲状腺素因素对血钾并没有作用,仅有胰岛素对降低血钾有作用(P0.05);甲状腺素因素和突变因素之间以及胰岛素因素和突变因素之间均有交互作用(P0.05);甲状腺素因素和胰岛素因素之间没有交互作用。部分4 FXYD1蛋白在甲亢性低钾型周期性麻痹致病中的作用:统计结果显示FXYD1蛋白表达水平在野生+盐水组与突变+盐水组二者之间并没有差异;突变+甲状腺素+盐水组、突变+甲状腺素+胰岛素组与突变+盐水组相比FXYD1蛋白表达均无统计学上差异(P0.05)。结论1.通过对Ca V1.1-R528H突变小鼠的鉴定,证实该突变基因在传代中不会发生丢失;2.本研究利用Ca V1.1-R528H突变小鼠首次成功的建立了甲亢性低钾型周期性麻痹模型;3.在甲亢性低钾型周期性麻痹中Na~+,K~+-ATP酶FXYD1亚基蛋白表达水平并没有发生改变。
【关键词】：甲亢性低钾型周期性麻痹 基因敲入 高甲状腺素 胰岛素 FXYD1
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R746.3;R-332
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 1 前言16-21
• 2 材料与方法21-26
• 2.1 材料21-22
• 2.2 实验方法22-25
• 2.3 统计学方法25-26
• 3 结果26-32
• 3.1 Ca V1.1-R528H 突变小鼠鉴定结果26
• 3.2 Ca V1.1-R528H 突变小鼠与野生型 C57BL/6J 小鼠生化指标比较结果26-27
• 3.3 突变、甲状腺素及胰岛素因素对血钾的作用27-30
• 3.4 FXYD1蛋白在甲亢性低钾型周期性麻痹致病中的作用30-32
• 4 讨论32-37
• 5 结论37-38
• 参考文献38-41
• 附录 个人简介41-42
• 致谢42-43
• 综述 胰岛素促进低钾型周期性麻痹机制的研究进展43-51
• 参考文献50-51

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1 智红叶;CaV1.1-R528H突变小鼠甲亢性低钾型周期性麻痹模型的建立及其机制的研究[D];安徽医科大学;2016年

  本文关键词：CaV1.1-R528H突变小鼠甲亢性低钾型周期性麻痹模型的建立及其机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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