HNF1A和FOXA2过表达诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为肝样细胞的研究

发布时间：2017-05-25 06:14

  本文关键词：HNF1A和FOXA2过表达诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为肝样细胞的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近年来研究人员发现骨髓间充质干细胞具有自我更新、高度可塑、免疫调节的性质,在体外易于分离和扩大培养,外源基因容易在细胞内导入和表达,具有跨胚层、向多种细胞分化的潜能等特点。其中诱导其分化为肝样细胞越来越受到国内外学者的关注,间充质干细胞诱导分化得到的肝样细胞为肝病治疗以及药物筛选提供了新的种子细胞。本研究选用FOXA2和HNF1A作诱导基因,通过慢病毒介导的方法将FOXA2和HNF1A同时在BMSCs中过表达。发现从侵染后第5天起,细胞形态发生变化,挑选出红色荧光蛋白表达、细胞形态有变化、长成集落的细胞团。然后通过筛选得到两个外源基因都稳定表达的细胞克隆,通过RT-PCR检测表明,上述细胞中肝细胞标记基因FOXA3、HNF4A、AFP、ALB、TAT、TTR、G6P、CYP1A1和CYP2B1等的转录产物呈阳性,而对照组BMSCs呈阴性;诱导后细胞的干性基因OCT4和NANOG表达呈阴性。细胞免疫荧光检测表明,上述诱导细胞表达AFP、ALB、G6P、CK18、TTR和TAT等肝细胞标记蛋白。Western blot检测表明,上述细胞的肝细胞相关蛋白ALB、G6P、TAT、TTR、CK18、AFP等特异性显色,而对照细胞BM-MSCs呈阴性。综上检测结果表明,被FOXA2和HNF1A过表达诱导的BMSCs具有肝细胞的分子特征。为了进一步验证诱导细胞的功能,本论文又采用PAS糖原染色、ICG摄入检测和油红O脂肪染色等方法来检测诱导细胞是否具有肝细胞的功能。结果表明,与对照组BMSCs相比,诱导细胞具有与类似肝细胞糖原储存能力、ICG代谢能力和脂肪储存能力。此结果进一步说明了FOXA2和HNF1A过表达能诱导BMSCs分化为肝样细胞。综上所述,本实验成功地通过一对新的转录因子组合定向诱导骨髓间充质干细胞分化成肝样细胞,同时还具有节省诱导时间和诱导效率较高等优点。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 叉头框蛋白A2(FOXA2) 肝细胞核因子1(HNF1A) 细胞定向分化 肝样细胞
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 缩略语表10-12
• 第一部分 文献综述12-28
• 1 骨髓间充质干细胞的研究进展13-16
• 1.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定13-14
• 1.2 骨髓间充质干细胞的多向分化潜能14-15
• 1.3 骨髓间充质干细胞的临床应用前景和挑战15-16
• 2 影响干细胞分化为肝样细胞的因素16-23
• 2.1 通过细胞因子作用获得肝样细胞17-18
• 2.2 通过化合物诱导获得肝样细胞18
• 2.3 通过基因修饰诱导获得肝样细胞18-19
• 2.4 通过细胞共培养诱导获得肝样细胞19-20
• 2.5 其它诱导获得肝样细胞方法20-22
• 2.6 诱导后细胞的鉴定及检测22
• 2.7 从成体干细胞、胚胎干细胞和诱导性多能干细胞获得的肝样细胞性质比较22-23
• 2.8 问题和展望23
• 3 HNF1A和FOXA2功能及其作用23-27
• 3.1 HNF1A的结构和功能23-25
• 3.2 FOXA2的结构和功能25-27
• 4 本研究的目的和意义27-28
• 4.1 研究目的27
• 4.2 研究意义27-28
• 第二部分 材料和方法28-49
• 1 实验材料28-32
• 1.1 实验动物、细胞及质粒28
• 1.2 主要试剂及溶液配制28-31
• 1.3 实验室仪器设备31
• 1.4 主要耗材31-32
• 2 试验方法32-49
• 2.1 构建两种重组慢病毒载体32-33
• 2.2 骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定和冻存33-34
• 2.3 鼠尾胶原的制备及使用34-35
• 2.4 细胞的复苏与培养35-36
• 2.5 目的基因慢病毒的包装及检测36-39
• 2.6 骨髓间充质干细胞的侵染和诱导39-41
• 2.7 诱导后细胞的检测41-49
• 第三部分 结果和讨论49-66
• 1 两种重组慢病毒载体构建结果49-50
• 2 骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定结果50-52
• 2.1 骨髓间充质干细胞的分离与培养结果50-51
• 2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定结果51-52
• 3 两种重组慢病毒的制备结果52-53
• 4 制备的重组慢病毒滴度检测结果53-54
• 5 慢病毒侵染BMSCS及其形态变化54-57
• 6 诱导细胞基因和蛋白表达变化57-60
• 6.1 诱导细胞的基因表达变化57-58
• 6.2 诱导细胞的蛋白表达变化58-60
• 7 诱导细胞功能检测结果60-62
• 7.1 糖原PAS染色结果60
• 7.2 ICG摄入检测结果60-61
• 7.3 油红O脂肪染色结果61-62
• 8 小结62
• 9 讨论62-66
• 结论66-68
• 参考文献68-78
• 致谢78-80
• 攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表的论文80-81

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本文编号：392871