重组融合蛋白TAT-p53对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用研究

发布时间：2017-05-26 16:20

  本文关键词：重组融合蛋白TAT-p53对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙肝病毒,一个主要的嗜肝DNA病毒,引起全球大约3.5亿人慢性感染,在我国有9300万慢性乙肝患者。在HBV感染肝细胞的过程中,闭合环状DNA(cccDNA)有效编码病毒蛋白,事实上,在HBV感染的病人患者体内,大量的HBsAg蛋白是通过病毒的cccDNA为模版进行合成的,其在血液中的浓度可以达到105 IU/mL。此外,我们和他人最近的研究结果表明,HBV的mRNA本身即可增强病毒的表达和复制,引起病毒持续性感染,并且通过miRNA所介导的网络促进HCC的发展。然而,当前的抗HBV药物发挥抗病毒活性主要通过抑制前基因组RNA形成HBV DNA的逆转录过程；或增强细胞的免疫应答,这些抗病毒药物并不能对病毒的mRNA的转录和蛋白的表达产生直接的影响,因此有必要研究针对病毒的转录和表达设计有效的抗病毒药物。HBV的转录由4个启动子(分别为pre-C/pregenomic, S1, S2和X启动子)所控制,两个增强子(增强子I和增强子II)在病毒基因转录中起到了重要作用。我们以前的研究结果表明,p53与HBV增强子的R-S元件相结合,并能显著抑制病毒启动子／增强子的活性。本研究的目的是设计和表达能抑制病毒转录和复制的重组p53蛋白,为研发新型抗乙肝病毒药物提供基础。首先设计细胞穿膜肽TAT (trans-activator of transcription)与p53融合的表达载体,在E.coli中成功表达重组融合蛋白。通过免疫荧光、Western blot和荧光报告基因检测证明通过穿膜肽TAT的介导,有效引导p53蛋白进入肝细胞内。接着研究TAT-p53的抗病毒功能,发现TAT-p53显著抑制HBV HBsAg和HBeAg的表达,使用TAT-p53处理可使HepG2.2.1.5细胞的HBsAg表达量下降3倍左右,同时real-time PCR、 Southern blot检测显示TAT-p53使病毒的转录水平和复制水平显著降低(P0.05或0.01)。进一步分析发现TAT-p53直接抑制病毒Enhancer Ⅰ/Ⅱ的活性,尤为重要的是可逆转病毒本身对Enhancer Ⅰ/Ⅱ的活化,CHIP检测表明TAT-p53与病毒结合,表明TAT-p53通过与病毒的增强子区域相互作用,从而有效地抑制HBV的转录和抗原的表达。现在,已被批准能治疗慢性乙型肝炎的抗病毒药包括a干扰素(IFN-a),以及核苷酸和核苷酸类似物(NA)。核苷酸类似物主要是抑制pgRNA逆转录为HBVDNA发挥抗病毒功能。然而,长期使用NA容易产生耐药性是制约其发展的缺点。进一步对TAT-p53的抗病毒功能与普遍使用的抗HBV药物拉米夫定进行比较,发现二者均能有效抑制病毒复制,但TAT-p53对病毒蛋白表达(HBsAg和HBeAg)有明显的抑制作用,而拉米夫定并不能明显影响病毒蛋白的表达。最后,通过HBV转基因鼠试验发现,TAT-p53有效抑制病毒的表达与复制,小鼠注射重组蛋白后HBsAg下降2-3倍,病毒转录和复制水平下降10倍以上,免疫组化结果显示肝脏中近70%的病毒被清除,显示TAT-p53具有强大的抗病毒活性。综上所述,本论文成功表达TAT-p53重组蛋白,通过细胞实验、HBV转基因鼠实验证明TAT-p53通过结合和抑制病毒Enhancer活性,显著降低病毒的转录、表达和复制,具有强大的抗病毒功能。和现有治疗病毒药(如拉米夫定)不同,TAT-p53能有效抑制病毒1mRNA转录和蛋白表达,鉴于在乙肝感染中HBV病毒蛋白和mRNA在免疫耐受和病毒持续性感染中发挥重要作用,TAT-p53独特的抗病毒功能使得它有望开发成为一种新型的抗病毒药物,我们的研究结果为抗HBV感染提供了新的治疗途径。
【关键词】：p53 乙肝病毒 HBsAg 增强子 TAT-p53 抗病毒
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩写词表7-11
• 前言11-19
• 第一部分 p53蛋白研究概况11-13
• 1. p53简介11
• 2. p53分子结构11-12
• 3. p53蛋白生物功能12-13
• 4. p53与HBV作用13
• 第二部分 穿膜肽TAT的分子结构和功能研究13-15
• 1. 穿膜肽简介13-14
• 2. TAT的分子结构14-15
• 3. TAT功能应用15
• 第三部分 乙型肝炎病毒HBV研究概况15-19
• 1. HBV简介15-16
• 2. HBV的病毒特征16-17
• 3. HBV的复制17-18
• 4. HBV的治疗策略18-19
• 材料和方法19-41
• 第一部分 实验材料19-24
• 1. 质粒及细胞系19
• 2. PCR引物19-20
• 3. 主要试剂及试剂盒20
• 4. 实验仪器20-21
• 5. 相关溶液的配制方法21-24
• 第二部分 实验方法24-39
• 1. 质粒构建24-25
• 2. 细胞培养25
• 3. 细胞转染25-26
• 4. ELISA实验26
• 5. Western blotting检测蛋白的表达水平26-28
• 6. 染色质免疫共沉淀(CHIP)28-30
• 7. 亚细胞蛋白质组提30-31
• 8. Daul-Luciferase报告基因监测系统31-32
• 9. 免疫组化32-33
• 10. 胞内免疫荧光染色33
• 11. 提取培养上清总DNA和荧光定量PCR33-34
• 12. CCK-8检测细胞增殖34-35
• 13. Southern blotting检测DNA的复制水平35-37
• 14. TAT-GST融合蛋白诱导表达条件的优化和纯化37
• 15. 包涵体蛋白的诱导表达和纯化37-38
• 16. 内毒素的去除与检测38-39
• 17. 小鼠实验39
• 第三部分 统计分析39-41
• 结果41-53
• 1、蛋白的表达纯化41-42
• 2、TAT介导重组的TAT-p53进入细胞42-44
• 3、TAT-p53抑制HBV的表达和复制的剂量选择44-46
• 4、TAT-p53抑制HBV的机制研究46-48
• 5、TAT-p53抑制HBsAg的产生48-50
• 6、TAT-p53在HBV转基因鼠中对HBV表达和复制的抑制作用50-53
• 讨论53-55
• 结论55-57
• 主要参考文献57-63
• 攻读学位期间成果63-65
• 致谢65

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