大肠杆菌O157:H7体内多聚磷酸盐的DAPI荧光定量检测

发布时间：2024-06-02 13:28

　　目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐(polyP)的可靠方法。方法提取并纯化大肠杆菌O157:H7野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80℃速冻溶解、-20℃速冻溶解、60℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1两个突变株polyP含量。结果应用360 nm激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm激发波长,DAPI-polyP最大发射波长为550 nm;应用405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光(425～475 nm),应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光(500～560 nm);最佳细菌前处理方法为-80℃速冻后室温下自然溶...

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 菌株和试剂
    1.2 方法
        1.2.1 DAPI-DNA与DAPI-polyP复合物发射光谱的扫描
        1.2.2细菌前处理
        1.2.3 EHEC O157:H7 WT株polyP的共聚焦定性观察及发射光谱扫描
        1.2.4 polyP含量的直接测定
        1.2.5 统计学处理
2 结果
    2.1 测定出DAPI-DNA与DAPI-polyP不同的最大发射波长
    2.2 比较发现-80℃速冻室温下自然溶解是最佳细菌前处理方法
    2.3 细胞内polyP的定性观察
    2.4 建立标准曲线
    2.5 各株菌polyP含量测定
3 讨论



本文编号：3987316