REGγ对不同信号传导功能的调节及其病理生理意义

发布时间：2017-05-27 07:18

  本文关键词：REGγ对不同信号传导功能的调节及其病理生理意义，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：REG γ亦称PSME3,PA28γ,是由PSME3编码的一种细胞核蛋白,在系统性红斑狼疮的病人血清中初次发现,可被自身免疫系统识别。REG γ属11S蛋白酶体激活因子家族,与20S蛋白酶体结合,可参与多种类型蛋白质的非泛素化非ATP依赖的降解。已有研究表明,REG γ可以介导多种细胞周期蛋白P21,P16,CK1δ等的降解,也可参与类固醇受体激活因子SRC3,转录因子NF-kB抑制因子IkBs的降解,调控下游基因的转录,对机体各项生理功能意义重大。本文主要研究REG γ对精神分裂症相关蛋白GSK3 β和能量代谢相关蛋白AMPK关系的初步探究。首先,我们在小鼠行为学实验中发现,REG γ敲除的小鼠认知能力和行为能力跟正常小鼠存在一定差异,显示出精神分裂症的类似症状。据报道,在精分患者的海马区,GSK3 β较正常人表达水平高,跟REG γ敲除小鼠海马区情况一致,但RNA水平没有显著差异。在抗体芯片试验中,我们发现GSK3 β是的直接底物。我们通过检测多种GSK3 β的底物蛋白水平,发现β-catenin在敲除REG γ的小鼠组织内含量较低。之后我们在敲除REG γ的人的神经母细胞瘤细胞系中发现了同样的情况,暗示我们REG γ可能通过降解GSK3 β来调控β-catenin水平,控制下游基因转录表达。我们在蛋白免疫共沉淀和细胞免疫荧光实验中发现REG γ可以跟GSK3 β发生共定位现象,进一步证实了我们的猜测,为精神分裂症的治疗提供了理论依据。大脑作为人体最重要的组织器官,通过神经-体液调节机制对机体各项生理活动进行调控,其脑部充足的能量供应为机体的稳态提供条件。我们在研究中发现在神经瘤母细胞中,AMPK作为调节能量代谢的关键蛋白,其磷酸化水平受REG γ的直接调控。为验证REG γ对能量调节的普遍性,我们对小鼠进行了另一种行为学实验。我们发现在小鼠的肌肉耐力行为学实验中,REG γ敲除的小鼠耐力高于正常小鼠,腓肠肌的肌肉切片SDH染色结果显示,敲除REG γ小鼠的琥珀酸脱氢酶表达明显高于正常小鼠。琥珀酸脱氢酶作为三羧酸循环的关键酶,是线粒体氧化能力和数目的标志,受腺苷酸活化蛋白激酶AMPK的调控。我们在蛋白水平实验中发现敲除REGγ的长时间运动训练的小鼠组织中,磷酸化AMPK水平明显高于正常小鼠,与线粒体氧化相关的基因PGC1-α, CPT-1b, Nampt, MFN, MCD等在RNA水平高于正常小鼠。饥饿小鼠的实验结果与上述实验结果一致。抗体芯片实验结果表明,AMPK是REG γ的直接底物蛋白,于是我们在细胞水平进行进一步研究。饥饿处理敲除REG γ的稳转成肌细胞系发现,磷酸化AMPK水平较REGγ正常细胞高,用AMPK激活因子AICAR、AMP处理细胞有相似结果,与线粒体氧化有关的多种蛋白在RNA水平上都相对较高。我们在HepG2稳转细胞系和成纤维细胞系中得到了类似的结果。为进一步证明REG γ是否直接调控AMPK,我们用DOX(潮霉素)诱导293WT细胞过表达REG γ后,发现过表达REG γ使AMPK总体水平无显著差异,但活性AMPK水平较低,敏感性较差。暗示我们REG γ可能会直接参与磷酸化AMPK的降解,进而对线粒体氧化产生影响,对肌肉耐力的提高有一定的抑制作用。这一研究表明,REG γ-AMPK途径会影响线粒体的功能数目,继而影响细胞能量代谢,此调控具有普遍性。
【关键词】：REGγ GSK3β 精神分裂症 AMPK 细胞能量代谢
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 综述13-30
• 1. 蛋白质降解13-16
• 1.1 蛋白酶体13-15
• 1.2 泛素依赖的蛋白酶体降解15-16
• 1.3 非泛素化依赖的蛋白质降解16
• 1.4 蛋白酶体降解的意义16
• 2. REGγ16-21
• 2.1 REG及REG γ16-18
• 2.2 REG γ生物学功能18-21
• 3. 精神分裂症21-25
• 3.1 精神分裂症简介21
• 3.2 分子机制21-25
• 4. 氧化代谢与AMPK25-30
• 4.1 线粒体生物功能与肌肉功能25-26
• 4.2 AMPK与线粒体功能26-30
• 第二章 实验材料和方法30-44
• 1. 实验材料30-32
• 1.1 小鼠30
• 1.2 细胞系30
• 1.3 感受态30
• 1.4 实验试剂和器材30-31
• 1.5 抗体31
• 1.6 引物31-32
• 2. 实验方法32-44
• 2.1 小鼠基因型鉴定32-33
• 2.2 小鼠跑台训练实验33-34
• 2.3 细胞培养,冻存,复苏34
• 2.4 细胞转染34
• 2.5 质粒构建与质粒提取34-36
• 2.6 蛋白质免疫印迹实验36-37
• 2.7 蛋白质免疫共沉淀实验37-38
• 2.8 定量PCR38-40
• 2.9 冰冻切片(用于SDH染色)40
• 2.10 SDH染色40
• 2.11 免疫荧光40-41
• 2.12 核质分离41
• 2.13 嘌呤霉素筛选稳转细胞系(shRNA稳定转染)41-44
• 第三章 实验结果和分析44-69
• 第一部分 REGγ对精神分裂症重要蛋白GSK3β的调控44-54
• 第一节 REGγ对精神分裂症重要蛋白GSK3β蛋白表达的影响44-48
• 1.1 REGγ对细胞内GSK3β基因的影响44-45
• 1.2 REGγ对细胞内GSK3β蛋白水平的影响45-46
• 1.3 REGγ对细胞内GSK3β活性影响46-47
• 1.4 实验小结47-48
• 第二节 REGγ对GSK3β及其底物蛋白降解的影响48-50
• 2.1 REGγ对GSK3β蛋白降解的影响48
• 2.2 REG Y对GSK3 p底物蛋白降解的影响48-49
• 2.3 实验小结49-50
• 第三节 REGγ对GSK3β作用区域的初步探究50-52
• 3.1 核质分离探究REGγ与GSK3β相互作用的亚细胞定位50-51
• 3.2 细胞免疫荧光探究REGγ与GSK3β的亚细胞定位51-52
• 3.3 Co-IP实验探究REGγ与GSK3β的关系52
• 3.4 实验小结52
• 第四节 实验总结52-53
• 第五节 展望53-54
• 第二部分 REGγ对肌肉功能及线粒体活性影响的初步探究54-69
• 第一节 REGγ对小鼠肌肉功能的影响54-58
• 1.1 REGγ对小鼠动物跑台实验和游泳实验表型的影响54-55
• 1.2 REGγ对小鼠肌肉线粒体功能相关基因表达的调控55-56
• 1.3 REGγ对运动小鼠肌肉中AMPK活性的调控56-57
• 1.4 实验小结57-58
• 第二节 REGγ对饥饿小鼠肌肉能量代谢的影响58-59
• 2.1 REGv对小鼠饥饿后线粒体功能的影响58
• 2.2 REGy对小鼠饥饿后AMPK功能的影响58-59
• 2.3 实验小结59
• 第三节 REGγ对细胞中能量代谢的影响59-65
• 3.1 REGγ对神经细胞中能量代谢的影响59-61
• 3.2 REGγ对肝细胞中能量代谢的影响61-63
• 3.3 REGγ对小鼠胚胎成纤维细胞中能量代谢的影响63-65
• 3.4 实验小结65
• 第四节 REGγ调控AMPK介导能量代谢机制的初步探究65-67
• 4.1 蛋白免疫共沉淀实验检测REGγ与AMPK的互作关系65-66
• 4.2 诱导REGγ高表达研究REGγ与AMPK的关系66-67
• 4.3 实验小结67
• 第五节 实验总结67
• 第六节 展望67-69
• 参考文献69-76
• 致谢76

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