碘和铅离子刺激性作用靶点发现和机制研究

发布时间：2017-06-02 03:11

  本文关键词：碘和铅离子刺激性作用靶点发现和机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：瞬时受体电位(TRPA1)通道是钙通透的阳离子通道TRP通道家族的一员,可被多种物理和化学刺激激活,参与多种生理和病理过程。单质碘作为一种高效广谱的消毒杀菌剂应用于临床已将近两个世纪,在预防和治疗感染方面发挥了巨大作用。限制碘临床应用的一个主要问题是它的伤害性刺激作用,如引起粘膜、伤口的剧烈疼痛。目前发展的各种新型碘杀菌剂主要通过控释技术降低游离碘在作用部位的浓度从而降低其刺激性。但碘伤害性刺激作用在体内的分子靶点从未被发现,其细胞、分子机制也从未得以阐明。论文通过活细胞钙荧光成像实验发现碘能够特异性激活外源性表达在HEK293细胞上的TRPA1通道和内源性表达在小鼠背根节(DRG)神经元中TRPA1通道；将人的TRPA1通道外源性表达在爪蟾卵母细胞和HEK293细胞,运用双电极电压钳和膜片钳技术发现TRPA1通道介导的电流也能够被碘激活,其ECso为0.2在动物实验水平,低于临床浓度的碘能够在小鼠中产生痛觉反应和促进接触性皮炎,TRPA1通道激活后,机体产生的下游神经肽SP参与了碘促进接触性皮炎的过程。本课题首次从分子、细胞、组织和动物水平探讨碘激活TRPA1机制以及TRPA1与碘伤害性刺激作用的关系,从而为含碘药物的进一步发展提供科学依据和理论基础,同时也将促进TRPA1受体药理学以及病理生理作用研究。环境铅污染严重危害人的健康,本研究首次发现铅离子对外周神经系统上的瞬时受体电位通道TRPA1有抑制作用。通过活细胞钙荧光成像实验发现铅离子能够抑制内源性表达在小鼠背根节(DRG)神经元中TRPA1通道以及外源性表达在HEK293细胞上的小鼠和人的TRPA1通道；另外将人的TRPA1通道外源性表达在爪蟾卵母细胞,运用双电极电压钳发现TRPA1通道介导的电流也能够被铅离子抑制,其ICso为2.4μM。这些结果表明,低浓度铅离子就能够抑制TRPA1通道。本研究为进一步认识和研究铅离子的神经毒性和铅中毒的临床治疗提供了分子水平上的依据。
【关键词】：碘 铅离子 TRPA1通道 DRG神经元 电生理 接触性皮炎
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 缩略表13-14
• 第一章 绪言14-26
• 1.1 含单质碘药物的现状14
• 1.2 含单质碘药物的发展14-15
• 1.3 碘分子杀菌消毒的作用机制和对人体的伤害性刺激作用15-16
• 1.4 铅污染现状16
• 1.5 临床铅中毒研究16-17
• 1.6 TRPA1通道与疼痛感受17-19
• 1.7 TRPA1通道与炎症反应19-21
• 1.8 实验证据表明碘激活TRPA1受体通道21
• 1.9 TRPA1是哺乳动物的伤害性化学感受器21-26
• 第二章 碘刺激性作用靶点发现和机制研究26-66
• 2.1 材料与仪器26-30
• 2.1.1 细胞系26
• 2.1.2 主要试剂、药品26-28
• 2.1.3 主要仪器28-30
• 2.2 主要溶液及配制30-34
• 2.3 实验方法34-42
• 2.3.1 TRPA1稳转细胞系的培养和传代34-35
• 2.3.1.1 细胞的冻存和复苏34-35
• 2.3.1.2 细胞的传代35
• 2.3.2 人和小鼠TRPA1通道基因的转染35
• 2.3.3 细胞内钙荧光信号检测35-36
• 2.3.3.1 细胞培养板的包被和细胞传代35-36
• 2.3.3.2 细胞Fura-2染色36
• 2.3.3.3 酶标仪检测钙荧光信号检测36
• 2.3.4 定点突变36-37
• 2.3.4.1 质粒的转化克隆36
• 2.3.4.2 细菌的扩大培养和质粒的提取36-37
• 2.3.4.3 基因的定点突变37
• 2.3.5 电极电压钳记录TRPA1通道电流37-38
• 2.3.5.1 TRPA1通道基因的RNA合成37
• 2.3.5.2 电极电压钳记录通道电流37-38
• 2.3.6 膜片钳记录TRPA1通道全细胞电流38
• 2.3.7 DRG神经元钙荧光成像38-39
• 2.3.7.1 小鼠基因型鉴定39
• 2.3.7.2 小鼠DRG神经元的原代培养39
• 2.3.7.3 钙荧光成像39
• 2.3.8 小鼠痛行为测定39-40
• 2.3.9 小鼠接触性皮炎模型的重建和实验40
• 2.3.10 药物的注射方式和剂量40-41
• 2.3.10.1 小鼠痛觉反应模型中HC030031的注射方式和剂量(按每只小鼠20 g计算)40-41
• 2.3.10.2 小鼠接触性皮炎模型药物注射方式和剂量(按每只小鼠20g计算)41
• 2.3.11 耳组织切片制作41-42
• 2.3.12 ELISA检测炎性因子42
• 2.4 实验结果42-59
• 2.4.1 碘特异性激活TRPA1通道42-44
• 2.4.1.1 不同载体的碘制剂均可激活外源性表达在HEK293细胞hTRPA1通道42-43
• 2.4.1.2 碘特异性激活外源性表达在HEK293细胞hTRPA1通道介导的钙离子内流43-44
• 2.4.2 碘作用于TRPA1通道的机制研究44-48
• 2.4.2.1 碘激活TRPA1通道剂量效应关系44-47
• 2.4.2.2 碘激活TRPA1的关键氨基酸位点和分子机制47-48
• 2.4.3 碘特异性激活DRG神经元中TRPA1通道介导的钙内流48-50
• 2.4.3.1 碘激活DRG神经元中TRPA1通道介导的细胞外钙内流48-49
• 2.4.3.2 TRPA1~(-/-)小鼠中碘激活神经元比例降低49-50
• 2.4.4 TRPA1通道介导碘诱导小鼠产生痛觉反应50-52
• 2.4.4.1 碘诱导小鼠产生痛觉反应50-51
• 2.4.4.2 碘诱导小鼠产生的痛觉反应可被TRPA1通道抑制剂减弱51
• 2.4.4.3 碘诱导小鼠产生的痛觉反应在TRPA1~(-/-)小鼠中明显降低51-52
• 2.4.5 TRPA1通道介导碘促进接触性皮炎52-59
• 2.4.5.1 恶唑酮诱导的炎症模型中诱导后炎症反应与诱导的恶唑酮浓度成正比52-53
• 2.4.5.2 碘浓度依赖性的促进小鼠接触性皮炎53-55
• 2.4.5.3 TRPA1通道抑制剂HC030031降低碘对迟发型炎症的促进作用55-56
• 2.4.5.4 SP的受体抑制剂降低碘对接触性皮炎的促进作用56
• 2.4.5.5 CGRP的受体抑制剂不影响碘对接触性皮炎的促进作用56-57
• 2.4.5.6 碘促进小鼠接触性皮炎在TRPA1~(-/-)小鼠作用明显降低57-59
• 2.5 讨论59-63
• 2.5.1 碘特异性激活TRPA1通道59
• 2.5.2 碘作用于TRPA1通道的机制和位点研究59-60
• 2.5.3 碘特异性激活DRG神经元上TRPA1通道介导的钙离子内流60
• 2.5.4 TRPA1通道介导碘诱导小鼠产生痛觉反应60-61
• 2.5.5 TRPA1通道介导碘促进接触性皮炎61-63
• 2.6 小结63-66
• 2.6.1 碘特异性激活TRPA1通道63
• 2.6.2 碘作用于TRPA1通道的机制和位点研究63
• 2.6.3 碘特异性激活DRG神经元上TRPA1通道介导的钙离子内流63
• 2.6.4 TRPA1通道介导碘诱导小鼠产生痛觉反应63-64
• 2.6.5 TRPA1通道介导碘促进接触性皮炎64-66
• 第三章 铅离子作用靶点和机制的研究66-78
• 3.1 材料与仪器66-69
• 3.1.1 主要试剂、药品66-68
• 3.1.2 主要仪器68-69
• 3.2 主要溶液及配制69-70
• 3.3 实验方法70-72
• 3.3.1 人和小鼠TRPA1通道基因的转染70-71
• 3.3.2 细胞内钙荧光信号检测71
• 3.3.2.1 细胞培养板的包被和细胞传代71
• 3.3.2.2 细胞Fura-2染色71
• 3.3.2.3 酶标仪检测钙荧光信号检测71
• 3.3.3 双电极电压钳记录TRPA1通道电流71-72
• 3.3.3.1 TRPA1通道基因的RNA合成71-72
• 3.3.3.2 电极电压钳记录通道电流72
• 3.4 实验结果72-76
• 3.4.1 铅离子抑制外源性表达在HEK293细胞的小鼠和人TRPA1通道介导的钙离子内流72-74
• 3.4.2 铅离子抑制TRPA1通道介导的电流74-75
• 3.4.3 铅离子抑制DRG中TRPA1通道介导细胞外钙内流75-76
• 3.5 讨论76-77
• 3.6 小结77-78
• 第四章 总结与展望78-80
• 致谢80-82
• 参考文献82-85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 肖小华;聚维酮碘的临床应用[J];局解手术学杂志;2005年01期

2 袁谊;鲁亚平;;铅对神经元离子通道的影响研究进展[J];生物学教学;2009年09期

3 戴晓青,阮迪云;铅抑制急性分离的大鼠背根神经节慢失活钾电流[J];中国药理学与毒理学杂志;2002年03期

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本文编号：414106