刚地弓形虫Prx体外抗氧化机制研究

发布时间：2017-06-02 20:23

  本文关键词：刚地弓形虫Prx体外抗氧化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)过氧化物氧化还原酶(peroxiredoxin,Prx)的基因,并制备多克隆抗体。使弓形虫Prx基因在Hep G2细胞过表达,不同终浓度H2O2诱导细胞凋亡,通过测定细胞的ROS生成量的变化来探讨Prx在细胞抗氧化中所起的作用以及作用机制。方法:构建原核表达载体Prx/p ET-28a(+)使之在大肠埃希氏菌(E.coil)Rosetta株中表达,通过对重组蛋白诱导表达时间、浓度和温度的优化及纯化,用纯化后的重组蛋白免疫家兔得到多克隆抗体,用Wesstern blotting的方法鉴定多克隆抗体的特异性。构建真核表达载体Prx/p3XFLAG-Myc-CMVTM-24使之在Hep G2细胞中表达,通过大量提取无内毒素质粒,利用非脂质阳离子聚合物Ronfect TM试剂将质粒转染至Hep G2细胞中,在24 h、48 h和72 h收集转染的细胞,用抗Prx多克隆抗体通过Wenstern blotting的方法检测Prx基因在Hep G2细胞的表达。24孔板接种培养Hep G2细胞24 h后,分别转染空载p3XFLAG-Myc-CMVTM-24质粒(空载转染组)和真核表达重组质粒Prx/p3XFLAG-Myc-CMVTM-24(转染组),收集细胞前24 h加入终浓度为200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L和1 600μmol/L的H2O2诱导细胞凋亡。于转染后48 h收集细胞,对细胞悬液用Annexin V-FITC/PI染色,利用流式细胞术检测细胞凋亡率。用DCFH-DA染色,利用流式细胞术检测细胞活性氧的生成量。结果:原核表达获取的多克隆抗体经过Wenstern blotting方法鉴定证明有很好的特异性,可用于后续试验。转染后24 h、48 h和72 h的Hep G2细胞,用Wenstern blotting方法在25 KDa处检测到有特异性行条带出现,与Prx理论大小相符,且Prx在48 h表达量最高。转染后48 h,H2O2终浓度为200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L转染组的凋亡率均低于转染空载组的凋亡率,两组差别有统计学意义(P0.05),终浓度为1 600μmol/L的转染组的凋亡率和转染空载组的凋亡率无明显差别。转染后48 h,H2O2终浓度为200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L的转染组的ROS的生成量低于空载组ROS的生成量,两组差别有统计学意义(P0.05),终浓度为1 600μmol/L的转染组的ROS生成量和空载组的ROS生成量无明显差别。结论:成功构建原核表达载体Prx/p ET-28a(+)并在Rosetta中大量表达,得到纯化后的重组蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,Wenstern blotting技术鉴定多克隆抗体有很好的特异性。成功构建真核表达载体,Prx蛋白在Hep G2细胞过表达,且转染后48 h表达量最高。弓形虫Prx具有抗氧化作用,其作用机制是,通过消除细胞内的ROS,从而减少氧化应激对虫体的损害,达到抗氧化的目的。
【关键词】：刚地弓形虫 过氧化物氧化还原酶 HepG2 细胞凋亡 ROS
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 主要缩略词表9-14
• 第一章 绪论14-18
• 1.1 弓形虫的致病机制14-15
• 1.2 Prx的研究现状15-16
• 1.3 细胞凋亡的机制和诱导因素16
• 1.4 弓形虫感染抑制细胞凋亡16-17
• 1.5 本研究的意义17-18
• 第二章 弓形虫PRX基因的原核表达及鉴定18-36
• 2.1 实验仪器和材料18-22
• 2.1.1 实验仪器18-19
• 2.1.2 实验材料19
• 2.1.3 实验试剂19-20
• 2.1.4 相关试剂的配制20-22
• 2.1.5 菌株和载体22
• 2.1.6 细胞和虫体22
• 2.2 实验方法22-30
• 2.2.1 He La细胞系的传代培养和虫体的传代培养22
• 2.2.2 弓形虫Prx基因的扩增22-24
• 2.2.3 重组载体Prx/p TG19-T的构建和鉴定24-26
• 2.2.4 重组表达载体Prx/p ET-28a（+）的构建与鉴定26-28
• 2.2.5 重组蛋白的诱导表达和可溶性分析28
• 2.2.6 重组蛋白的纯化28-29
• 2.2.7 兔多克隆抗体的制备和鉴定29-30
• 2.3 结果30-34
• 2.3.1 弓形虫Prx基因扩增结果30-31
• 2.3.2 重组Prx/p TG19-T质粒的鉴定31
• 2.3.3 重组质粒Prx/p ET-28a（+）的双酶切鉴定31-32
• 2.3.4 重组蛋白的诱导表达32-33
• 2.3.5 重组蛋白的纯化33
• 2.3.6 多克隆抗体的鉴定33-34
• 2.4 讨论34-36
• 第三章 弓形虫P3×FLAG-MYC-CMVTM24PRX在HEPG2细胞中表达36-46
• 3.1 实验材料和仪器36-37
• 3.1.1 实验材料36
• 3.1.2 实验试剂36
• 3.1.3 实验仪器36
• 3.1.4 细胞株和菌株36-37
• 3.1.5 相关试剂的配制37
• 3.2 实验方法37-42
• 3.2.1 弓形虫Prx基因的扩增37
• 3.2.2 重组载体Prx/p TG19-T的构建与鉴定37-38
• 3.2.3 重组表达载体Prx/p3×FLAG-Myc-CMVTM-24 的构建与鉴定38-39
• 3.2.4 真核表达质粒Prx/p3×FLAG-Myc-CMVTM-24 的大量提取39-40
• 3.2.5 Hep G2细胞的复苏和传代40-41
• 3.2.6 p3×FLAG-Myc-CMVTM24Prx转染Hep G2细胞41-42
• 3.2.7 Western blotting技术检测Prx的表达42
• 3.3 结果42-44
• 3.3.1 弓形虫Prx基因扩增结果42-43
• 3.3.2 重组载体Prx/p TG19-T的单酶切鉴定结果43
• 3.3.3 重组真核表达质粒Prx/p3×FLAG-Myc-CMVTM-24 的双酶切鉴定43-44
• 3.3.4 Western blotting技术检测Prx在Hep G2细胞中的表达44
• 3.4 讨论44-46
• 第四章 弓形虫PRX体外抗氧化研究46-56
• 4.1 实验仪器和材料46-47
• 4.1.1 实验仪器46-47
• 4.1.2 实验材料47
• 4.1.3 实验试剂47
• 4.1.4 试剂配制47
• 4.1.5 细胞47
• 4.2 实验方法47-49
• 4.2.1 Hep G2细胞的复苏和传代47
• 4.2.2 Hep G2细胞的转染与凋亡诱导47-48
• 4.2.3 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡48-49
• 4.2.4 细胞ROS检测49
• 4.2.5 数据统计49
• 4.3 实验结果49-52
• 4.3.1 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率的结果49
• 4.3.2 细胞ROS检测的结果49-52
• 4.4 讨论52-56
• 结论与展望56-58
• 参考文献58-66
• 致谢66-68
• 在学期间发表的学术论文及参加课题：68-69

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