衰老引起肠系膜上动脉内皮功能损伤的机制

发布时间：2017-06-03 19:15

  本文关键词：衰老引起肠系膜上动脉内皮功能损伤的机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的血液流动产生的剪切力作用于血管内皮细胞,从而调节血管张力和直径。内皮细胞内剪切力诱导产生一些血管舒张因子使血管平滑肌扩张是影响血管直径扩张的主要因素。瞬时感受器电位通道(TRP)家族香草素受体亚家族(TRP vanilloid subtype 4,TRPV4)参与了这一过程,它是钙通透的非选择阳离子通道,介导了内皮细胞内钙离子增加。本研究中,利用血管直径检测系统比较年轻大鼠与老年大鼠肠系膜上动脉剪切力以及TPPV4通道激动剂4α-PDD诱导的血管舒张程度。利用钙成像技术检测原代培养的内皮细胞(mesenteric artery endothelial cells,MAECs)剪切力以及4α-PDD诱导的细胞内钙离子浓度变化。采用蛋白免疫印迹以及免疫荧光染色法比较老年大鼠与年轻大鼠肠系膜上动脉内皮细胞内的TRPV4蛋白含量表达水平。方法1.动物分组雄性清洁级成年Sprague-Dawley大鼠,分为两组:年轻大鼠3~4月龄,老年大鼠20~22月龄。2.原代培养肠系膜上动脉内皮细胞将分离出的肠系膜上动脉置于10 m L含0.02%的胶原蛋白酶PBS(phosphate-buffered saline)液中,置于37oC恒温水浴振荡器中荡分离出内皮细胞,种于培养皿,放入CO2温箱中培养3-5天,用于后续实验。3.钙离子成像用钙离子荧光指示剂Fluo-8和普流罗尼类F-127孵育细胞30min。荧光比率(F1/F0)表示细胞内钙离子浓度的变化。莱卡TCS SP5共聚焦系统记录并分析荧光信号。以毒胡萝卜素诱导钙库释放后,加入TRPV4通道蛋白抑制剂RN1734,再加入钙离子,观察细胞内钙离子浓度变化;改变浴槽两侧压力,观察老年组和年轻组肠系膜上动脉内皮细胞剪切力诱导细胞内钙离子浓度变化情况。4.检测肠系膜上动脉血管直径变化将分离好的肠系膜上动脉血管段固定于血管直径检测系统(Danish Myo Technology,Denmark,model 110P)中,观察老年大鼠和年轻大鼠肠系膜上动脉剪切力诱导内皮依赖性血管舒张的变化;使用TRPV4通道抑制剂RN1734,阻断TRPV4通道,观察肠系膜上动脉剪切力诱导的内皮依赖性血管舒张的变化;使用TRPV4通道激动剂4α-PDD,观察老年大鼠和年轻大鼠肠系膜上动脉剪切力诱导内皮依赖性血管舒张的变化。5.蛋白免疫印迹和免疫荧光染色:使用anti-TRPV4抗体,分别检测老年大鼠和年轻大鼠肠系膜上动脉内皮细胞TRPV4蛋白表达的水平。6.统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析,实验数据采用均数±标准误(`x±SE)表示,组间样本比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P0.05视为差异具有统计学意义。结果1.剪切力诱导引起大鼠肠系膜上动脉剪切力引起的血管舒张反应与内皮细胞钙浓度的变化。与年轻组相比,老年组肠系膜上动脉剪切力诱导的血管舒张反应和原代培养的肠系膜上动脉内皮细胞剪切力诱导Ca2+浓度升高的效应明显减弱;2.4α-PDD诱导的血管舒张以及其引起的内皮细胞内钙离子浓度变化与年轻大鼠相比,老年大鼠TRPV4通道蛋白激动剂4α-PDD诱导的血管舒张反应明显减弱;与年轻组相比,加入TRPV4通道蛋白激动剂4α-PDD诱导的肠系膜上动脉内皮细胞胞内Ca2+浓度升高明显减弱;3.验证TRPV4在剪切力诱导的肠系膜动脉内皮细胞钙浓度增加和血管舒张的作用。TRPV4通道蛋白抑制剂RN1734显著抑制剪切力诱导的肠系膜上动脉内皮细胞内Ca2+浓度升高和血管舒张反应;4.蛋白免疫印迹与免疫荧光染色与年轻大鼠相比,老年大鼠肠系膜上动脉内皮细胞中TRPV4蛋白表达水平均显著降低。结论TRPV4参与调节内皮依赖性剪切力诱导的钙离子浓度升高与血管舒张,,TRPV4蛋白水平表达降低与其介导的钙信号减弱可能参与了衰老引起的大鼠肠系膜上动脉内皮功能损伤。目的内皮功能障碍是导致心血管疾病的主要原因,并且引起心血管系统复杂的结构和功能的改变[1,2,3]。老化会导致相关的血管内皮以及平滑肌功能障碍[2]。同时内皮细胞与平滑肌细胞间传导通路与交流也发生改变[2]。血管内皮细胞功能主要由几种因子的调节,包括内皮依赖性舒张因子(EDRF),内皮依赖性收缩因子(EDCF),内皮依赖性超极化因子(EDHF)[3,4,5]。老化过程伴随着血管内皮产生的血管舒张物质和血管收缩物质之间的平衡减弱。这一失衡可能会引起一氧化氮生物利用率下降以及环氧合酶产生的收缩因子减少[3,4,5]。这些现象与衰老过程中的促炎性细胞因子表达升高有关,也影响相关酶的活性和表达[6,7]。钙库操纵钙离子内流(SOCE)是血管内皮细胞中调节钙离子内流的主要机制[8,9],细胞内钙库的清空导致细胞外钙离子内流[8]。SOCE补偿了细胞内钙库,更重要的是调节了各种细胞反应[8]。在血管内皮细胞中,SOCE参与调节血管张力,血管通透性,以及其他功能[10,11]。但钙库操纵钙离子内流(SOCE)作为内皮细胞钙平衡的重要调节机制[12]在衰老引起内皮细胞功能障碍中的作用却未见相关报道。本研究通过探讨衰老对肠系膜上动脉内皮细胞(MAECs)SOCE影响及其介导的血管舒张功能的影响。方法1.动物分组雄性成年SD大鼠,分为两组:年轻大鼠3~4月龄,老年大鼠20~22月龄。2.原代培养肠系膜上动脉内皮细胞将分离出的肠系膜上动脉置于10 m L含0.02%的胶原蛋白酶的PBS(phosphate-buffered saline)液中,置于37℃恒温水浴振荡器中振荡30 min出内皮细胞,种于培养皿,放入CO2温箱中培养3-5天,用于后续实验。3.钙离子成像用钙离子荧光指示剂Fluo-8和普流罗尼类F-127孵育30 min。荧光比率(F1/F0)表示细胞内钙离子浓度的变化。莱卡TCS SP5共聚焦系统记录并分析荧光信号。以毒胡萝卜素和缓激肽诱导钙库释放后,加入钙离子,观察细胞内钙离子浓度变化。4.检测肠系膜上动脉血管直径变化将分离好的肠系膜上动脉血管段固定于血管直径检测系统(Danish Myo Technology,Denmark,model 110P)中,比较老年和年轻大鼠缓激肽(BK)引起肠系膜上动脉血管舒张反应5.免疫荧光染色免疫荧光染色技术比较Orai 1和基质相互作用因子(STIM 1)在老年和年轻大鼠肠系膜上动脉内皮细胞表达情况。6.统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析,实验数据采用均数±标准误(`x±SE)表示,组间样本比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P0.05视为差异具有统计学意义。结果1.与年轻大鼠相比,缓激肽引起的老年大鼠肠系膜上动脉血管舒张功能减弱了;2.在原代培养的肠系膜上动脉内皮细胞,毒胡萝卜素与缓激肽诱导的SOCE分别减弱;3.SOCE的组成成分Orai 1和STIM 1表达明显减少。结论衰老引起大鼠肠系膜上动脉内皮细胞的SOCE及其介导的血管舒张功能显著减弱,SOC通道组成蛋白Orai 1与STIM 1蛋白表达水平降低可能参与这一改变。
【关键词】：TRPV4 内皮细胞 剪切力 肠系膜上动脉 血管舒张 肠系膜上动脉 内皮细胞 钙库操纵钙内流 基质相互作用因子1 Orai1 PartⅡ
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R339.38
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-6
• 第一部分：TRPV4参与衰老引起的大鼠肠系膜上动脉剪切力诱导的内皮依赖性血管舒张功能损伤6-32
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-20
• 结果20-27
• 讨论27-28
• 结论28-29
• 参考文献29-32
• 第二部分：衰老引起的肠系膜上动脉内皮细胞钙库操纵钙内流减弱的研究32-51
• 中文摘要32-34
• 英文摘要34-37
• 前言37-38
• 材料与方法38-41
• 结果41-47
• 讨论47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-51
• 附录51-53
• 致谢53-54
• 综述54-68
• 参考文献63-68

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本文编号：419005