抗人胱抑素C单克隆抗体的制备及初步鉴定

发布时间：2017-06-06 17:09

  本文关键词：抗人胱抑素C单克隆抗体的制备及初步鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:制备抗重组人胱抑素C(cystatin C,Cys C)单克隆抗体,并测量其浓度,对其生物学性质进行一个初步鉴定(包括免疫反应性、亚型、效价、相对亲和力、是否能与天然蛋白结合)。为进一步组装Cys C临床测量试剂盒,以及探究Cys C的其他生物学作用打下牢固的基础。方法:以本实验室原核表达的人Cys C重组蛋白免疫BALB/c小鼠,在聚乙二醇1500的作用下使小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0发生融合,采用有限稀释法筛选出稳定分泌抗Cys C的杂交瘤细胞株(即阳性克隆),向BALB/c小鼠腹腔注入杂交瘤细胞,抽取小鼠产生的腹水,采用protein A亲和层析柱纯化腹水。测定单克隆抗体的浓度使用BCA法,测定单克隆抗体的免疫反应性使用Western Blot,测定单克隆抗体的亚型、效价和相对亲和力使用间接ELISA法。将辣根过氧化物酶(HRP)与单克隆抗体偶联,重组蛋白作为抗原筛选出最佳配对抗体,并用双抗夹心法测定天然Cys C蛋白。结果:运用经典的单克隆抗体制备技术,筛选出了抗Cys C单克隆抗体的7株杂交瘤细胞,分别命名为4E3、4G2、4E2、4H2、4G4、8E1、8G4。向小鼠腹腔注入杂交瘤细胞,获得了抗Cys C单克隆抗体浓度很高的腹水。protein A亲和层析柱纯化腹水效果良好,测定已纯化的抗体浓度最高的可达1.475mg/m L。7株单克隆抗体均有较强的免疫反应性和较高的相对亲和力,经抗体亚型鉴定,其中5株为Ig G1型,2株为Ig G2a型。使用间接ELISA法检测自主研发的抗体效价均可达1:104。采用双抗夹心法,当8E1作为包被抗体,8G4作为酶标抗体的情况下,测得的OD值最高,使用此抗体对可以检测出血清中的天然Cys C。结论:(1)创建了抗重组人Cys C单抗杂交瘤细胞库,经有限稀释法筛选得到了7株抗Cys C单抗杂交瘤细胞。(2)通过杂交瘤培养技术和小鼠腹腔注射制备了大量的单克隆抗体,纯化后对其生物学性质进行了初步鉴定,证明了其具有良好的抗体反应性及亲和力。(3)医院收集的天然Cys C可与自主研发的单克隆抗体相结合,为今后进一步建立Cys C检测方法,组装商品化试剂盒打下了牢固的基础。
【关键词】：胱抑素C 单克隆抗体 特性鉴定
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 材料与方法14-27
• 2.1 材料14-19
• 2.1.1 主要仪器14-15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.1.3 常用溶液配制16-18
• 2.1.4 ELISA相关试剂的配制18
• 2.1.5 细胞培养相关试剂18-19
• 2.2 方法19-27
• 2.2.1 重组胱抑素C对小鼠的免疫19-20
• 2.2.2 单克隆抗体的制备20-22
• 2.2.3 单克隆抗体的纯化22-23
• 2.2.4 单克隆抗体的浓度测定23
• 2.2.5 单克隆抗体的性质分析23-25
• 1）Western blotting鉴定抗体活性23-24
• 2）单克隆抗体的亚型分析24
• 3) 间接ELISA法测定单抗效价24
• 4) 相对亲和力测定24-25
• 2.2.6 单克隆抗体标酶及配对25-26
• 2.2.7 双抗体夹心法检测临床血清标本26-27
• 第三章 结果27-34
• 3.1 间接ELISA检测免疫小鼠血清效价27
• 3.2 细胞融合27-28
• 3.3 抗重组胱抑素C单克隆抗体的筛选28
• 3.4 单克隆抗体的纯化28-29
• 3.5 单克隆抗体蛋白浓度测定29-30
• 3.6 单克隆抗体的初步鉴定30-32
• 3.6.1 单克隆抗体的免疫反应性检测30
• 3.6.2 单克隆抗体的亚型分析30-31
• 3.6.3 间接ELISA鉴定单克隆抗体的效价31-32
• 3.6.4 相对亲和力的测定32
• 3.7 单克隆抗体标酶及配对32-33
• 3.8 双抗体夹心法检测临床血清标本33-34
• 第四章 讨论34-39
• 1、动物免疫34-35
• 2、细胞培养35
• 3、细胞融合35-37
• 4、产生抗体的类型37
• 5、抗体生产37-38
• 6、抗体纯化38-39
• 第五章 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述44-54
• 参考文献49-54
• 附录一：缩略词对照表54-55
• 附录二：硕士在读期间学术成果55-56
• 致谢56-57

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