小核仁RNA在维持人多能干细胞自我更新中的作用及机制

发布时间：2017-06-07 13:13

  本文关键词：小核仁RNA在维持人多能干细胞自我更新中的作用及机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究背景与目的】胚胎干细胞(ESC)是多能干细胞中多能性最强的细胞系,具有广阔的研究以及应用前景[1]。然而由于胚胎干细胞多能性的维持机制复杂,目前尚未明确,使得胚胎干细胞的实际应用受到限制[2]。与之相比,脐带血间充质干细胞(uMSCs)多能性水平相对较低,却是一类颇受重视的多能性细胞,已成为再生医学细胞治疗中有前景的候选者[3,4]。目前,uMSCs在部分疾病治疗中的应用已得到FDA批准[5]。但是,一些潜在的问题的存在限制了其应用。众所周知[4,6-8],临床应用级uMSCs需要具有高活性,且需要量大,而在体外培养条件下uMSCs扩增代数有限,一旦超出这个范围细胞将会出现分化或者老化,细胞的生物学活性显著降低,在疾病治疗中的价值也随之丧失。因此,保持细胞的自我更新能力,维持其增殖活性,抑制其分化是未来间充质干细胞研究的重点,对其临床应用价值的判定具有重要意义。近期研究证实,小核仁RNA(small noculear RNA,snoRNA)在细胞增殖过程中具有重要作用[9],这为我们提供了新思路。遗憾的是关于此类功能的研究主要集中在肿瘤细胞增殖中,而有关snoRNA与干细胞调控之间的相关性却几无报道。另外,近年来研究发现部分特殊snoRNAs经切割可生成更小的功能性RNAs,即snoRNAs衍生RNAs[10,11](snoRNAs derived RNAs,sdRNAs),这些sdRNAs中部分具有微小RNAs(microRNAs,miRNAs)的特征[11,12],可发挥类似miRNA的作用,这一发现极大地拓展了snoRNAs的作用机制方式。本组研究的目的在于探究一些特殊snoRNAs及其sdRNAs在干细胞中的自我更新维持中的作用及机制。第一部分:C/Dbox SnoRNA3A(U3)促进hESCs多能性方法:(1)通过高通量测序技术检测hESC分化前后差异表达的snoRNA。通过Northern Blot鉴定C/Dbox snoRNA3A(SNORD3A,U3)、SNORD58(C/Dbox snoRNA58A)及snoRD69(C/Dbox snoRNA69)的内源性表达情况。(2)在hESCs中进行过表达和抑制U3、U3-sd RNA,通过Real-time PCR、AP染色等试验检测其对hESCs多能性的影响。(3)通过FISH及核质分离实验检测U3-sd RNA在hESCs中的分布情况。(4)构建体外切割体系及核质分离实验研究U3具体产生位置(5)构建U3突变体检测U3-sd RNA的形成规律。结果:(1)Northern Blot实验发现在高通量分析中表达量变化显著的U3在不同分化程度的细胞系中表达差异不显著,但其衍生small RNA在不同细胞系内的表达量呈现为hESCsuMSCs293T。(2)U3和U3-sd RNA过表达的hESCs多能性基因表达量均显著增高,克隆显著增多,而抑制U3-sd RNA后结果相反(3)FISH与核质分离实验显示,U3-sd RNA胞核内含量显著低于胞质。(4)体外切割后Northern Blot鉴定显示,hESCs胞质与U3共孵育可产生更多U3-sd RNA(5)6组突变体过表达结果显示,过表达Mut-1、Mut-2组细胞产生克隆数与对照组无明显差异。其他四种类型突变体过表达后均可以显著提高hESCs的克隆形成率结论:U3可以维持甚至提高胚胎干细胞多能性。这一作用主要通过在胞质内经酶切形成的sdRNA实现。另外,sdRNA的产生主要与snoRNA的二级结构有关。第二部分H/ACA SnoRNA7A促进huMSCs的自我更新方法:(1)干扰H/ACA snoRNAs核心蛋白DKC1、NOP10后通过Real-time PCR、Western Blot等方法检测uMSCs多能性及增殖能力的变化。(2)芯片数据检测uMSCs分化前后差异表达的snoRNAs。(3)在uMSCs中进行过表达和抑制SNORA7A通过Real-time PCR、Western Blot、EDU、克隆形成、细胞倍增时间等方法检测其对uMSCs多能性及增殖能力的影响。(4)构建突变SNORA7A核心蛋白结合位点的过表达载体,通过Real-time PCR、Western Blot、EDU、克隆形成、细胞倍增时间等试验检测其对uMSCs多能性及增殖能力的影响。(5)成脂和成骨诱导方法检测SNORA7A对uMSCs分化的调控作用。结果:(1)H/ACA box SnoRNA在uMSCs增殖能力以及自我更新能力的维持中发挥重要作用(2)SNORA7A在调控uMSCs增殖活性发挥重要作用(3)过表达SNORA7A可以提高7A的自我更新能力(4)抑制SNORA7A可显著抑制uMSCs自我更新能力(5)SNORA7A对uMSCs自我更新的调控主要通过功能单位snoRNP实现(6)DKC1是SNORA7A发挥作用的关键分子(7)SNORA7A具有抑制uMSCs成脂以及成骨分化的作用结论:内源性SNORA7A在uMSCs的增殖以及自我更新过程中发挥重要作用。该作用主要通过形成snoRNP产生。同时,SNORA7A在uMSCs体外培养状态下自我更新能力的维持中起到至关重要的作用小结不同snoRNA在干细胞自我更新中发挥不同作用,且作用机制不同。U3可以维持甚至提高胚胎干细胞多能性。这一作用主要通过在胞质内经酶切形成的sdRNA实现。内源性SNORA7A在uMSCs的增殖以及自我更新过程中发挥重要作用。该作用主要通过形成snoRNP产生。
【关键词】：人胚胎干细胞 人脐带间充质干细胞 小RNA 小核仁RNA 自我更新 增殖 多能性
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-13
• 第一部分：C/Dbox SnoRNA3A(U3)促进hESCs多能性13-33
• 一、前言13-15
• 二、材料与方法15-23
• 三、结果23-31
• 四、讨论31-33
• 第二部分：H/ACA box小核仁RNA 7A对uMSCs的影响及机制研究33-57
• 一、前言33-34
• 二、材料与方法34-40
• 三、结果40-55
• 四、讨论55-57
• 附录57-60
• 文献综述 小核仁RNAs及其衍生RNAs的研究进展60-67
• 前言60
• 一、SnoRNAs结构、分类及其生物学功能60-62
• 二、snoRNAs衍生的sdRNA与miRNA之间相关性研究进展62-66
• 三、snoRNAs的研究价值及临床应用66-67
• 参考文献67-75
• 在读期间论文发表和科研工作情况说明75-76
• 致谢76-78

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1 刘静;A Novel Vector for Abundant Expression of Antisense RNA, Triplex forming RNA and Ribozyme in vivo[J];High Technology Letters;2000年04期

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3 梁小兵 ,万国江 ,黄荣贵;Distribution and Variation of Ribonucleic Acid (RNA) and Protein and Its Hydrolysis Products in Lake Sediments[J];Chinese Journal of Geochemistry;2002年02期

4 Verheyden B ,徐其武;口服脊髓灰质炎疫苗核壳和RNA的稳定性[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2002年01期

5 CMBE译文组;探索小RNA的功能[J];现代临床医学生物工程学杂志;2004年03期

6 沈维干;RNA interference and its current application in mammals[J];Chinese Medical Journal;2004年07期

7 孙娣;汪洋;张丽娟;闫玉清;;一种简捷提取植物总RNA的方法[J];黑龙江医药;2005年06期

8 南海波;;小麦总RNA的提取[J];渤海大学学报(自然科学版);2006年01期

9 王冬来;;RNA干扰的成功与困惑[J];中国生物化学与分子生物学报;2008年06期

10 杨静;;试验性的小RNA药物可能引发失明[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年05期

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1 金由辛;;面向21世纪的RNA研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）[C];1999年

2 ;第四届RNA全国研讨会大会报告日程安排[A];第四届全国RNA进展研讨会论文集[C];2005年

3 ;Function of Transfer RNA Modifications in Plant Development[A];植物分子生物学与现代农业——全国植物生物学研讨会论文摘要集[C];2010年

4 王峰;张秋平;陈金湘;;棉花总RNA的快速提取方法[A];中国棉花学会2011年年会论文汇编[C];2011年

5 关力;陈本iY;iJ云虹;郭培芝;魏重琴;邱苏吾;苗健;;关于动物}D~T中RNAn,定方法的研究[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编（生物化学）[C];1964年

6 夏海滨;;小RNA在免疫学领域中的应用研究进展[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

7 ;The stability of hepatitis C virus RNA in various handling and storage conditions[A];中国输血协会第四届输血大会论文集[C];2006年

8 郭德银;;RNA干扰在病毒研究和控制中的应用[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

9 甘仪梅;杨业华;王学奎;曹燕;杨特武;;棉花总RNA快速提取[A];中国棉花学会2007年年会论文汇编[C];2007年

10 ;Identification and characterization of novel interactive partner proteins for PCBP1 that is a RNA-binding protein[A];中国优生优育协会第四届全国学术论文报告会暨基因科学高峰论坛论文专辑[C];2008年

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1 记者 冯卫东;研究人员发现可破坏肿瘤抑制基因的小RNA[N];科技日报;2009年

2 记者 储笑抒 通讯员 盛伟;人体微小RNA有望提前发出癌症预警[N];南京日报;2011年

3 泸州医学院副教授、科普作家 周志远;“大头儿子”与环状RNA[N];第一财经日报;2014年

4 麦迪信;小分子RNA可能有大作用[N];医药经济报;2003年

5 董映璧;美发现基因调控可回应“RNA世界”[N];科技日报;2006年

6 张忠霞;特制RNA轻推一下,就能“唤醒”基因[N];新华每日电讯;2007年

7 聂翠蓉;RNA：纵是配角也精彩[N];科技日报;2009年

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