Nrf2重组慢病毒对细胞增殖、凋亡和分化的影响及小鼠ACLT骨关节炎模型的建立与鉴定

发布时间：2017-06-07 22:15

  本文关键词：Nrf2重组慢病毒对细胞增殖、凋亡和分化的影响及小鼠ACLT骨关节炎模型的建立与鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的构建转录因子NF-E2相关因子(NF-E2 related factor,Nrf2)重组慢病毒(lentivirus),靶向Nrf2和ATF4(activating transcription factor 4)的si RNA重组慢病毒颗粒;探究Nrf2基因的重组慢病毒修饰对细胞向成骨细胞及软骨骨细胞分化过程中增殖、凋亡和分化的影响;建立小鼠膝盖前交叉韧带切除术(anterior cruciate ligament transection,ACLT)的骨关节炎发病模型。方法将载有目的基因Nrf2序列的慢病毒骨架质粒p WPT-GFP-Nrf2与p MD2G、p SPAX2慢病毒包装质粒共同转染于293T细胞中,完成Nrf2慢病毒的包装,同理设计并完成Lv-si Nrf2和Lv-ATF4慢病毒的构建与包装;在BMP2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化的过程中,设立不同的病毒处理组,检测Nrf2及ATF4对C2C12细胞增殖、凋亡及分化的影响;高密度微团培养C3H10细胞,并在BMP2处理下诱导其向软骨细胞分化,检测Lv-Nrf2对C3H10向软骨细胞分化过程中增殖和凋亡的影响,胎鼠腿骨组织体外培养,设立不同病毒处理组,腿组织包埋切片后,Tunel染色检测胎鼠软骨组织的凋亡情况,免疫组织化学法检测凋亡相关蛋白在软骨组织中的表达与分布;手术建立小鼠ACLT骨关节炎模型并对其进行评估鉴定。结果成功包装了重组慢病毒Lv-Nrf2、Lv-si Nrf2及Lv-si ATF4(滴度约为1×108efu/m L);BMP2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化过程中,FCM的结果显示,BMP2+Lv-Nrf2组细胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP组,BMP2+Lv-si Nrf2组细胞凋亡率高于BMP2+Lv-GFP组,BMP2+Lv-Nrf2+Lv-si ATF4组细胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP组并同时低于BMP2+Lv-si ATF4组;western结果与FCM凋亡结果一致;免疫细胞化学结果显示,实验组BMP2+Lv-Nrf2组中骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)与碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)表达增高,而BMP2+Lv-si Nrf2组中两种蛋白表达均降低,联合处理组BMP2+Lv-Nrf2+Lv-si ATF4中两种蛋白表达低于对照组和BMP2+Lv-Nrf2组;在BMP2诱导微团培养的C3H10细胞向软骨细胞分化过程中,FCM的结果显示,与空病毒处理组相比,Lv-Nrf2组C3H10凋亡率下降,细胞中占S期的细胞比例上升;western结果与FCM结果一致;Tunel细胞荧光染色结果显示,与空病毒处理组相比,Lv-Nrf2处理组细胞凋亡率显著下降;Tunel荧光及组织化学染色对胎鼠腿骨石蜡切片进行染色,结果显示,与Lv-GFP处理组相比,Lv-Nrf2可以减少胎鼠腿骨组织中软骨细胞凋亡的发生;成功在野生型小鼠和PGRN缺陷型小鼠中建立ACLT骨关节炎模型;PGRN缺陷型小鼠比野生型小鼠ACLT手术后,骨关节炎的症状更加严重。结论一方面,在BMP2诱导C2C12细胞成骨分化过程中,Nrf2基因可抑制C2C12细胞的凋亡,促进其向成骨分化,同时,可挽回因ATF4蛋白减少而产生的细胞凋亡;另一方面,在BMP2诱导微团培养的C3H10细胞向软骨细胞分化过程中,Nrf2可抑制C3H10细胞的凋亡并促进细胞的增殖,对软骨组织的细胞具有一定保护作用;小鼠ACLT模型在构建后8周时,关节炎的症状最为明显,PGRN基因可能参与关节软骨的损伤修复,可能参与骨关节炎的发生过程。
【关键词】：Nrf2 慢病毒 骨细胞 分化
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684.3;R-332
【目录】：

• 符号说明4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-11
• 第一部分：重组慢病毒的构建与包装11-20
• 1 材料与方法11-17
• 2 结果17-19
• 3 讨论19-20
• 第二部分：Nrf2对C2C12细胞增殖，凋亡和分化的影响20-29
• 1 材料与方法20-22
• 2 结果22-27
• 3 讨论27-29
• 第三部分：软骨细胞分化中LV-Nrf2对细胞增殖与凋亡的影响29-39
• 1 材料与方法29-32
• 2 结果32-38
• 3 讨论38-39
• 第四部分：小鼠ACLT骨关节炎模型的构建与鉴定39-50
• 1 材料与方法39-42
• 2 结果42-48
• 3 讨论48-50
• 全文总结与讨论50-53
• 参考文献53-56
• 文献综述56-67
• 参考文献63-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 史晨辉;王维山;李长俊;张振东;郭风劲;陈安民;;慢病毒介导uPA-siRNA重组表达载体的构建及促进兔软骨细胞增殖[J];基础医学与临床;2014年05期

2 许朝;胡端敏;诸琦;;EEF1A2基因慢病毒表达载体的构建及慢病毒表达系统的建立[J];生物学杂志;2013年02期

3 韩腾龙;王立峰;张t

本文编号：430501