脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化中TGF-β1和Runx2表达的影响

发布时间：2017-06-07 23:11

  本文关键词：脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化中TGF-β1和Runx2表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：原代培养大鼠成骨细胞,探讨成骨细胞受脂联素作用后生物学行为的改变；检测不同浓度脂联素作用下成骨细胞TGF-β1和Runx2基因和蛋白表达的变化,探讨脂联素对骨改建的作用及其可能作用机制。方法：1、脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化的影响①、采用二次酶消化法进行大鼠成骨细胞原代培养,倒置显微镜观察细胞生长状态。经矿化诱导14天后,用茜素红钙结节染色,进行成骨细胞鉴定；②、取第3-5代生长良好的成骨细胞,用浓度为4μg/ml脂联素作用成骨细胞0、1、3、5、7、9d,采用MTT法检测脂联素对成骨细胞增殖活性的影响；③、取第3-5代成骨细胞,用浓度为4μg/ml脂联素作用成骨细胞0、1、3、5、7、9d,检测脂联素对成骨细胞表达碱性磷酸酶活性的影响；④、取第3-5代成骨细胞,分别用0、1、2、4、8μg/ml浓度脂联素作用7d,使用ELISA法检测TGF-β1和Runx2蛋白的表达水平；2、脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化作用通路的研究①、用浓度为5μmol/L的TGF-β1抑制剂SB431542,分别预处理成骨细胞15min、30min、1h、2h、4h,再加入浓度为4μg/ml脂联素培养成骨细胞7d。分别用浓度为0、1、2.5、5、10、20μmol/L的TGF-β1抑制剂SB431542,预处理成骨细胞2h,再加入浓度为411 g/ml旨联素培养成骨细胞7d。分别采用MTT法检测TGF-β 1抑制剂SB431542对成骨细胞增殖活性的影响,确定TGF-β1抑制剂SB431542发挥作用的最适浓度和作用时间;②, ELISA法检测TGF-β1抑制剂拮抗脂联素对TGF-β1蛋白表达的影响。分为5组,对照组：不加入脂联素,不加入SB431542; APN组：只加入浓度为4μg/ml的脂联素；SB431542+APN组：用浓度为5μmol/L的SB431542预处理2h后,再加入浓度为4μg/ml的脂联素；SB431542组：只用浓度为5μmol/L的SB431542预处理2h；DMSO组：加入DMSO。各组成骨细胞分别培养7d后,ELISA法检测TGF-β1蛋白的表达；③、RT-qPCR法检测TGF-β1抑制剂拮抗脂联素对Runx2 mRNA表达的影响。分为5组,对照组：不加入脂联素,不加入SB431542;APN组：只加入浓度为4μg/ml的脂联素；SB431542+APN组：用浓度为5μmol/L的SB431542预处理2h后,再加入浓度为4μg/ml的脂联素;SB431542组：只用浓度为5μmol/L的SB431542预处理2h；DMSO组：加入DMSO。各组成骨细胞分别培养7d后,RT-qPCR检测Runx2 mRNA的表达。结果：1、脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化的影响①倒置显微镜观察,成骨细胞接种24 h后细胞充分铺展,形态多样,呈三角形、梭形、多角形等不规则形。细胞爬满瓶底后可呈复层生长,并在局部聚集成灶,形成钙结节,通过茜素红染色法可使钙结节染成橘红色。②MTT结果显示：脂联素作用成骨细胞后,0D值持续升高,在7d达到高峰(P0.05),之后便呈下降趋势,时间到9d时,0D值仍高于对照组(P0.05)。③碱性磷酸酶活性检测显示：脂联素作用成骨细胞后,碱性磷酸酶活性逐渐增高,在7d达最高水平(P0.05),之后便呈下降趋势,时间到9d时,0D值仍高于对照组(P0.05)。④ELISA检测显示：成骨细胞在不同浓度脂联素作用后,TGF-β1和Runx2蛋白的表达均上调,浓度在4μg/ml时,TGF-β1和Runx2蛋白的表达量最高,各组组间差别有统计学意义(P0.05)。2、脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化作用机制的研究①MTT检测显示：用不同浓度的TGF-β1抑制剂SB431542,分别预处理成骨细胞不同时间后,0D值均下降,0D值在抑制剂浓度为5μmol/L,作用时间为2h时最低(P0.05),各组组间差别有统计学意义(P0.05)。(9)ELISA检测显示：APN组可明显上调TGF-β1蛋白的表达,与对照组比较(P0.05); SB431542+APN组可显著阻断脂联素对TGF-β1蛋白表达的上调作用,APN组与SB431542+APN组比较,差异有统计学意义(P0.05)；对照组、SB431542组、DMSO组间无统计学意义(P0.05)。③RT-qPCR检测显示：与对照组相比,APN组可明显上调Runx2 mRNA的表达(P0.05); SB431542+APN组可明显降低脂联素对Runx2 mRNA表达的上调作用,APN组与SB431542+APN组比较,差异有统计学意义(P0.05)；对照组、SB431542组、DMSO组间无统计学差异(P0.05)。结论：1、脂联素作用成骨细胞后,可通过增加TGF-β1和Runx2的合成,促进成骨细胞的成熟和分化,进而参与调节骨改建。2、TGF-β1抑制剂阻断脂联素对成骨细胞TGF-β1和Runx2表达的上调作用,TGF-β1和Runx2表达呈明显下降趋势。提示Runx2作为TGF-β1的下游信号分子,介导了脂联素诱导大鼠成骨细胞在成骨分化中TGF-β1的信号传递,参与了脂联素促进大鼠成骨细胞的成骨分化。
【关键词】：脂联素 成骨细胞 TGF-β1 Runx2
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 个人简历3-5
• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化的影响17-31
• 1 实验材料17
• 2 实验方法17-21
• 3 实验结果21-27
• 4 讨论27-30
• 5 小结30-31
• 第二部分 脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化作用通路的研究31-41
• 1 实验材料31
• 2 实验方法31-34
• 3 实验结果34-38
• 4 讨论38-40
• 5 小结40-41
• 全文总结41-43
• 参考文献43-46
• 综述46-58
• 参考文献55-58
• 临床病例报告58-68
• 致谢68-70
• 攻读学位期间发表的论文70

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  本文关键词：脂联素对大鼠成骨细胞成骨分化中TGF-β1和Runx2表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：430623