日本血吸虫高迁移率族蛋白活化小鼠巨噬细胞和树突状细胞的功能研究

发布时间：2017-06-09 19:13

  本文关键词：日本血吸虫高迁移率族蛋白活化小鼠巨噬细胞和树突状细胞的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血吸虫病广泛流行于非洲、亚洲和南美,是仅次于疟疾的一种寄生虫病。血吸虫病的长期防控依赖于高效疫苗的应用。目前国际上公认的具有较高保护力效果的疫苗是辐照致弱的尾蚴/童虫疫苗(RAV),但由于材料来源困难、安全性等问题,不能大规模使用。因此,需要通过研究RAV模型的高保护性效应机制来研发出高效、安全的抗血吸虫分子疫苗。研究发现RAV模型可诱导宿主产生高水平的以Th1为优势应答的高保护力,其原因可能是辐照后虫体损伤严重,移行缓慢,长期滞留在肺部并伴随大量虫源性分子的释放,引起宿主较强的免疫反应。高迁移率族蛋白(HMGB1)是一种核蛋白,在电离辐射条件下可从核内迁移至胞外。已有研究表明曼氏血吸虫HMGB1可诱导宿主巨噬细胞释放大量的致炎细胞因子,是引发宿主炎症反应的关键分子。因此推测日本血吸虫HMGB1(SjHMGB1)作为虫源性的应激分子在RAV诱导的高保护力中发挥了类似的重要作用。本研究旨在探索SjHMGB1在活化宿主免疫细胞,调节免疫反应上的功能。为进一步阐明SjHMGB1在RAV中发挥的作用奠定基础。1、分析SjHMGB1在辐照与正常虫体细胞上的表达情况。体外培养不同期别的辐照和正常童虫,用胰酶消化成单个细胞。流式细胞术检测结果显示SjHMGB1在辐照早期4 d时的表达量明显高于正常组,7 d时显著下降低于正常组(P0.01),10 d、14 d两者无显著差异;RT-PCR检测SjHMGB1的mRNA的转录水平发现辐照组在4 d、7 d显著高于正常组(P0.01),在10 d时两组无显著差异。初步推断SjHMGB1在辐照童虫早期大量表达释放。2、分析reSjHMGB1诱导致敏小鼠淋巴细胞的反应。reSjHMGB1蛋白刺激致敏小鼠淋巴细胞48h后,MTT法检测淋巴细胞增殖、流式细胞术检测淋巴细胞亚群状况以及胞内细胞因子的表达情况。结果显示该蛋白能够显著的刺激致敏小鼠淋巴细胞增殖(SI2);蛋白免疫组CD4+/CD8+T细胞的比值为2.28显著高于对照组的1.76(P0.01),且胞内IFN-?的表达量显著增加(P0.01)。提示SjHMGB1蛋白可诱导小鼠产生Th1型免疫应答。3、分析reSjHMGB1在调节宿主固有免疫中的作用。reSjHMGB1与RAW264.7细胞共孵育48 h,通过流式细胞术检测细胞表面分子、ELISA检测胞外细胞因子。结果表明reSjHMGB1刺激组与对照组相比,RAW264.7细胞表面Toll受体4(TLR4)受体上调表达,差异极显著(P0.01),而Toll受体2(TLR2)受体下调表达(P0.05),同时胞外TNF-α和NO的分泌量显著增加(P0.01)。提示SjHMGB1可通过TLR4通路诱导巨噬细胞向致炎性的M1型巨噬细胞分化。4、研究reSjHMGB1诱导宿主树突状细胞(DC)功能成熟。reSjHMGB1刺激分选后的DC 48 h后再与CD4+T细胞共孵育168 h,流式细胞术检测DC表面分子、胞内细胞因子和T细胞增殖情况,ELISA检测胞外细胞因子分泌情况。结果表明reSjHMGB1刺激组DC细胞表面的趋化因子受体CCR7和CXCR4显著上调表达(P0.01),同时胞外TNF-α,IFN-?,IL-4的含量显著增加(P0.01)。reSjHMGB1蛋白与DC和CD4+T共孵育实验结果表明,CD4+T释放IFN-?显著增加(P0.01)。提示SjHMGB1促进DC功能成熟,活化CD4+T细胞,诱导Th1型免疫应答。5、初步探索reSjHMGB1活化嗜中性粒细胞的功能。蛋白刺激嗜中性粒细胞4 h后,通过显微镜观察嗜中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的形成,RT-PCR检测细胞因子的mRNA转录水平。实验结果表明蛋白刺激后可观察到明显的NETs现象,且与对照组相比MMP-9,MCP-1,CCL-3和CXCL-2的mRNA转录水平显著提高(P0.01)。提示SjHMGB1能够刺激嗜中性粒细胞向炎症表型分化。综上所述,本研究发现SjHMGB1在辐照童虫早期大量表达及释放,能够活化巨噬细胞、促进DC功能成熟、活化CD4+T细胞并诱导其向Th1型分化。初步探索了SjHMGB1刺激嗜中性粒细胞胞外陷阱形成的过程。为进一步阐明SjHMGB1在RAV模型中所发挥的作用和机制奠定了基础。
【关键词】：日本血吸虫 高迁移率族蛋白B1 巨噬细胞 树突状细胞
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R383.24
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 绪论13-23
• 1.1 血吸虫生物学概述13-15
• 1.1.1 血吸虫及其生活史13-14
• 1.1.2 血吸虫的流行病学特点14
• 1.1.3 血吸虫的致病机理14-15
• 1.2 血吸虫疫苗研究概况15-16
• 1.3 辐照致弱血吸虫疫苗的研究进展16-17
• 1.4 HMGB1分子的结构及其生物学功能17-20
• 1.4.1 HMGB1分子的结构17-18
• 1.4.2 HMGB1分子的生物学功能18-20
• 1.4.3 血吸虫HMGB1的研究20
• 1.5 固有免疫和适应性免疫应答20-23
• 1.5.1 固有免疫和适应性免疫应答的区别与联系20-22
• 1.5.2 血吸虫抗原诱导Mφ极化及活化DC的功能与机制22-23
• 第二章 SjHMGB1在辐照与正常日本血吸虫童虫细胞上的表达分析23-33
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 尾蚴23
• 2.1.2 实验动物23
• 2.1.3 主要试剂和仪器23-24
• 2.1.4 溶液配制24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 收集体外培养不同期别辐照与正常日本血吸虫童虫24-25
• 2.2.2 RT-PCR检测SjHMGB1基因的mRNA转录水平25-27
• 2.2.3 SjHMGB1在辐照和正常虫体细胞内的表达研究27-28
• 2.3 实验结果28-31
• 2.3.1 不同期别虫体SjHMGB1基因的mRNA转录水平比较28-29
• 2.3.2 SjHMGB1多克隆抗体特异性分析29-30
• 2.3.3 SjHMGB1在辐照和正常虫体细胞内的表达研究30-31
• 2.4 讨论31-33
• 第三章 SjHMGB1诱导致敏小鼠淋巴细胞反应的研究33-41
• 3.1 实验材料33-34
• 3.1.1 实验动物33
• 3.1.2 实验细胞33
• 3.1.3 主要试剂和仪器33-34
• 3.2 实验方法34-37
• 3.2.1 免疫小鼠34
• 3.2.2 真核蛋白的制备34
• 3.2.3 MTT法检测混合淋巴细胞增殖34-35
• 3.2.4 致敏小鼠脾脏淋巴细胞亚群的测定35
• 3.2.5 混合淋巴细胞胞内细胞因子检测35-36
• 3.2.6 混合淋巴细胞胞外细胞因子检测36-37
• 3.3 实验结果37-40
• 3.3.1 脾脏混合淋巴细胞的增殖情况37
• 3.3.2 淋巴细胞亚群的测定37-38
• 3.3.3 混合淋巴细胞胞内细胞因子检测38-39
• 3.3.4 混合淋巴细胞胞外细胞因子检测39-40
• 3.4 讨论40-41
• 第四章 SjHMGB1活化巨噬细胞的功能分析41-52
• 4.1 实验材料41-42
• 4.1.1 实验细胞41
• 4.1.2 主要试剂和仪器41-42
• 4.2 实验方法42-44
• 4.2.1 细胞常规培养42
• 4.2.2 SjHMGB1蛋白刺激巨噬细胞增殖现象42
• 4.2.3 SjHMGB1蛋白刺激巨噬细胞分泌到上清中NO水平42-43
• 4.2.4 流式细胞术检测细胞表面分子43
• 4.2.5 RT-PCR检测细胞因子mRNA转录水平43-44
• 4.2.6 ELISA检测胞外细胞因子44
• 4.3 实验结果44-50
• 4.3.1 SjHMGB1蛋白刺激巨噬细胞增殖现象44-45
• 4.3.2 SjHMGB1蛋白促进巨噬细胞释放NO45-46
• 4.3.3 SjHMGB1上调巨噬细胞表面受体分子以及MHC-Ⅱ分子的表达46-48
• 4.3.4 RT-PCR检测细胞因子mRNA转录水平48-49
• 4.3.5 ELISA检测胞外细胞因子49-50
• 4.4 讨论50-52
• 第五章 SjHMGB1促进DC功能成熟的鉴定52-64
• 5.1 实验材料52-53
• 5.1.1 实验动物52
• 5.1.2 主要试剂和仪器52-53
• 5.1.3 溶液配制53
• 5.2 实验方法53-58
• 5.2.1 流式细胞术检测BMDC表面受体53-55
• 5.2.2 RT-PCR检测细胞因子与趋化因子受体mRNA转录水平55-56
• 5.2.3 ELISA检测SjHMGB1刺激BMDC胞外细胞因子56
• 5.2.4 CFSE检测CD4+T细胞增殖56-58
• 5.2.5 ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子58
• 5.3 实验结果58-62
• 5.3.1 流式细胞术检测SjHMGB1刺激BMDC表面受体表达情况58-59
• 5.3.2 RT-PCR检测趋化因子受体与细胞因子的mRNA转录水平59-60
• 5.3.3 ELISA检测SjHMGB1刺激BMDC胞外细胞因子水平60
• 5.3.4 CFSE法检测CD4+T细胞增殖60-61
• 5.3.5 ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子61-62
• 5.4 讨论62-64
• 第六章 SjHMGB1诱导嗜中性粒细胞胞外陷阱的形成64-73
• 6.1 实验材料64-65
• 6.1.1 尾蚴64
• 6.1.2 实验动物64-65
• 6.1.3 主要试剂和仪器65
• 6.2 实验方法65-68
• 6.2.1 Western Blot检测嗜中性粒细胞胞内histone3的含量65-66
• 6.2.2 RT-PCR检测细胞因子与趋化因子mRNA转录水平66-67
• 6.2.3 日本血吸虫虫卵及可溶性虫卵蛋白（SEA）的制备67-68
• 6.2.4 嗜中性粒细胞胞外陷阱（NETs）现象68
• 6.3 实验结果68-72
• 6.3.1 Western Blot检测嗜中性粒细胞胞内histone3的含量68-69
• 6.3.2 嗜中性粒细胞细胞因子与趋化因子mRNA转录水平69-70
• 6.3.3 嗜中性粒细胞胞外陷阱（NETs）现象70-72
• 6.4 讨论72-73
• 第七章 全文总结73-74
• 参考文献74-80
• 攻读学位期间取得的研究成果80-81
• 1.发表论文80
• 2.作者简介80-81
• 致谢81

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