一株1型单纯疱疹病毒参考株的建立及特性分析

发布时间：2017-06-10 13:20

  本文关键词：一株1型单纯疱疹病毒参考株的建立及特性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV1)是疱疹病毒科α病毒亚科的一员,能引起多种疾病,包括龈口炎,病毒性脑炎,角膜结膜炎等,能够感染多种细胞并在体内感染中建立潜伏感染。针对HSV感染目前还没有疫苗和完全清除体内病毒的药物被研发出来。此外,HSV由于其具有大型环状DNA和神经潜伏感染的特征,在研究神经系统疾病时可以作为载体而得到广泛的应用。本研究中从临床病人口唇部疱液分离得到一株病毒,通过Vero细胞扩增纯化,通过PCR分析、电镜鉴定确定该病毒为1型HSV,命名为HSV1-ZW6,对其进行病毒增值特性分析,包括对其感染不同细胞病变形态学分析、一步生长曲线的绘制、小鼠神经毒力检测试验等,结果提示此分离株与实验室传代毒株HSV1-8F相比,其神经毒力略高于HSV1-8F。利用高通量测序技术对此株病毒基因组进行了测序,联合Sanger测序对其进行修补,最终获得了150290bp的病毒全基因组序列,并通过对全基因进行基因预测和注释获得其全基因组结构图,选取部分基因进行亲缘关系进化树绘制和简单重复序列分析,发现位于IRL/TRL区的一段32个A/T重复的特征序列。根据已知序列,利用CRISPR-Cas9技术快速获得了一株带有绿色荧光蛋白的重组病毒ZW6-EGFP。此外,本研究在建立了二倍体细胞KMB17细胞代次与端粒长度变化模型的基础上,在细胞水平检测了单纯疱疹病毒感染KMB17细胞后,对感染后端粒长度的影响,初步发现HSV1感染KMB17细胞后会对其产生影响,而感染癌细胞或永生化细胞系则未发现相似结果。通过对HSVl的分离、鉴定及全基因组测序完成,本研究建立了一株新的HSV1参考株及其相应的报告病毒,利用该病毒研究病毒与细胞之间的相互作用进行了初步探索,更多的生物特性还有待进一步的深入研究。
【关键词】：单纯疱疹病毒 全基因组 测序 重组病毒 端粒
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-8
• 第一部分 1型单纯疱疹病毒的分离鉴定及增殖特性分析8-23
• 1 前言8-10
• 2 实验材料10-12
• 2.1 细胞10
• 2.2 引物序列10
• 2.3 试剂及耗材10-11
• 2.4 实验动物11
• 2.5 仪器设备11-12
• 3 实验方法12-16
• 3.1 细胞培养12
• 3.2 病毒分离12-13
• 3.3 病毒蚀斑纯化13
• 3.4 病毒PCR鉴定13-15
• 3.5 病毒的电镜观察15
• 3.6 病毒滴度测定15
• 3.7 病毒在不同细胞增殖特性15
• 3.8 病毒生长曲线测定15
• 3.9 动物神经毒力实验15-16
• 4 实验结果16-21
• 4.1 病毒的噬斑纯化16
• 4.2 病毒PCR检测16-17
• 4.3 病毒电镜结果17-18
• 4.4 病毒在不同细胞病变情况18-19
• 4.5 病毒感染不同细胞生长曲线测定19-20
• 4.6 动物神经毒力实验20-21
• 5 实验讨论21-23
• 第二部分 低代次1型疱疹病毒全基因组测序及初步分析23-51
• 1 前言23-25
• 2 实验材料25-30
• 2.1 病毒株和细胞25
• 2.2 引物序列25-29
• 2.3 主要参考序列29-30
• 2.4 序列分析软件及在线分析系统30
• 3 实验方法30-34
• 3.1 病毒全基因组提取30
• 3.2 基因组限制性片段长度多态性分析30-31
• 3.3 病毒全基因组的二代测序31
• 3.4 病毒全基因组的修补31-33
• 3.5 病毒全基因组序列的组装及提交33
• 3.6 病毒全基因组分析33-34
• 4 实验结果34-46
• 4.1 病毒基因组提取及限制性片段长度多态性分析34-35
• 4.2 基因组Illumina测序结果35
• 4.3 基因组的PCR缺口修补35-37
• 4.4 病毒基因组基因预测37
• 4.5 病毒基因组结构37-39
• 4.6 病毒的点阵分析39
• 4.7 进化树的构建39-42
• 4.8 病毒基因组简单重复序列分析42-46
• 5 实验讨论46-51
• 第三部分 基于CRISPR-Cas9技术的重组单纯疱疹病毒的构建51-57
• 1 前言51-52
• 2 实验材料52
• 2.1 病毒株及细胞52
• 2.2 质粒52
• 2.3 引物序列52
• 3 实验方法52-53
• 3.1 细胞转染52
• 3.2 病毒感染52
• 3.3 病毒的噬斑纯化52-53
• 3.4 PCR检测病毒TK基因53
• 4 实验结果53-55
• 4.1 Cas9诱导病毒基因组同源重组53-54
• 4.2 重组病毒的噬斑纯化及TK基因检测54-55
• 5 实验讨论55-57
• 第四部分 HSV1与端粒长度变化的细胞模型建立的初步研究57-65
• 1 前言57-58
• 2 实验材料58
• 2.1 病毒株和细胞58
• 2.2 引物序列58
• 3 实验方法58-59
• 3.1 病毒感染58
• 3.2 病毒感染后细胞端粒长度测定58-59
• 4 实验结果59-63
• 4.1 端粒长度PCR产物琼脂糖凝胶电泳59-60
• 4.2 标准曲线绘制60-61
• 4.3 KMB17随传代次数增加端粒缩短61
• 4.4 病毒感染对细胞端粒影响61-63
• 5 实验讨论63-65
• 实验小结65-66
• 参考文献66-71
• 附录Ⅰ HSV1-ZW6全基因组序列编码基因列表71-77
• 附录Ⅱ 重组荧光病毒测序77-78
• 附录Ⅲ 英文缩写词表78-79
• 附录Ⅳ 主要溶液及培养基配制79-82
• 致谢82-83
• 研究生简历83-84

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