结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响

发布时间：2017-06-10 14:15

  本文关键词：结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:结核菌的持留性和结核分枝杆菌的耐药性为目前控制结核病的两大难题,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的持留性,结核持留菌的存在是结核病感染呈现慢性化的最主要原因。结核持留菌在机体内的存在是临床上诊断和治疗结核病时结核菌的潜伏感染、结核病复发、结核菌耐药、迁延不愈,结核病治疗期限延长、预后不佳等一系列问题发生的原因,持留菌通过多种渠道和方式从抗结核药物的灭菌和机体的免疫系统杀伤中逃逸出来,保持了结核分枝杆菌在环境中的稳定性和对机体内环境的适应性和无反应性,导致耐药和持留。至今结核分枝杆菌的持留的机制尚未完全明确,持留的途径尚未完全揭开,因此临床上迄今为止并没有针对结核持留菌进行完全有效治疗的方法,并进一步控制结核病。而研究发现MTB能进入巨噬细胞,且被巨噬细胞吞噬后,由于巨噬细胞内特殊基因的表达,导致了结核菌对巨噬细胞胞内环境的适应,从而达到持留作用。结核分枝杆菌基因组者全序列的阐明基础研究中为临床上根除持留菌从基因和分子生物学的角度为揭开结核杆菌持留生存的机制提供了理论支持。MTBeis基因仅存在于致病性MTB中,可抑制细胞保护性免疫反应,增加非致病性MTB在宿主细胞内的持留,eis基因产物Eis蛋白为一可溶性分泌蛋白,分子量大致为42kd,能作用于巨噬细胞,有研究证实该42kd蛋白能够影响巨噬细胞肿瘤坏死因子(tunlornecrosisfactor,tnf)-a和白介素(interlukin,il)-10的分泌,有效的抑制了单核巨噬细胞细胞的活化而与持留的的关联。本课题组之前何师姐的实验结果已经证实结核分枝杆菌eis基因的产物eis蛋白能够提升巨噬细胞吞噬耻垢分枝杆菌之后耻垢杆菌于宿主巨噬细胞内的生存率,结核分枝杆菌在单核巨噬细胞内的比较具体的持留机制尚不清楚。目前已有文献指出,机体细胞因子表达和分泌的变化对机体的免疫和结核分枝杆菌在巨噬细胞的持留和潜伏感染都会产生影响,eis基因可增加结核菌在巨噬细胞的持留是否与其可能影响吞噬细胞细胞因子的分泌和作用有关,目前文献中报到的很少。IL-10具有非常广泛的生物学的活性,其为一种多功能的机体负性免疫调节的细胞因子,是一种免疫抑制性的细胞因子,且有高效性。能改变机体免疫应答和mhcⅡ类抗原表达,也可选择性抑制巨噬细胞某些方面的功能,也抑制了对t细胞和b细胞的功能。本次实验的主要目的即使为了要探索eis基因对结核分枝杆菌感染单核巨噬细胞之后的巨噬细胞分泌和表达的各种细胞因子影响,筛选出具有差异性表达的细胞因子,为进一步从细胞免疫入手研究eis基因持留机制提供实验依据。方法:1.以rpmi1640培养基(内含10%胎牛血清)培养浓度为1×105的thp-1细胞,之后pma诱导细胞使thp-1细胞分化,将重组结核分枝杆菌ms-pmv261-eis及对照菌ms-pmv261培养7天后离心集菌,少量培养基用力吹打、震荡混合均匀,紫外光分光光度计计算细菌浓度,最后按moi=10:1感染thp-1细胞分化的巨噬细胞。2.取细胞上清液,用elisa方法检测eis基因对thp-1细胞中il-10的影响将thp-1细胞种至6孔板,以pma诱导分化24小时后以pbs清洗细胞并以重组分枝杆菌感染细胞,18h收集细胞上清液,室温下1000g离心15min,取100hul以elisa检测il-4,il-6,il-10,il-12,inf-γ表达情况;根据标准品浓度和测得的od值绘制成为标准曲线,根据描绘的标准曲线计算出各实验组细胞因子的浓度。3.收集细胞提取细胞总rna,rt-pcr检测试剂盒进一步检测il-10的浓度,在基因层面的表达。18h后收集细胞,提取总rna,根据上述elisa检查结果设计特异性表达il-10细胞因子的引物,rt-pcr检测进一步确证该细胞因子的基因表达。引物序列:上游引物:5’-ggcttcctaactgctaca-3’下游引物:5’-ctcctgacctcaagtgat-3;反应条件:pcr反应条件为:95oc预变性5min;95oc变性30s,60oc退火30s,72oc延伸30s,共35个循环后再72oc延伸10min。pcr扩增结束,pcr扩增的产物进行收集,后进行1%琼脂糖凝胶电泳。4.用统计学分析数据,spss15.0统计软件,以x±s表示,两组进行t检验。结果:1.pma成功诱导thp-1细胞转化为巨噬细胞,重组结核分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照菌MS-pmv261,按MOI=10:1感染Thp-1细胞分化的巨噬细胞。2.ELISA结果显示,结核分枝杆菌eis基因可引起IL-10 OD值明显增加(P0.05),而对细胞因子IL-4、IL-6、IL-12、INF-γ的表达无显著影响(P0.05)3.收集细胞后提取的巨噬细胞细胞RNA,之后进行的RT-PCR的检测,测定的结果为IL-10的mRNA条带的表达增强。结论:1.提取细胞培养的细胞上清液,检测eis基因对巨噬细胞分泌以及表达和IL-10等细胞因子的影响,以ELISA方法。结果表明eis基因能够上调IL-10的表达(P0.05),而对IL-4、IL-6、IL-12、INF-γ的表达无显著影响(P0.05)。2.RT-PCR检测进一步IL-10mRNA条带增强,从基因水平表明eis基因上调IL-10的表达。
【关键词】：结核分枝杆菌 eis基因 单核巨噬细胞 白介素-10
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 参考文献17-18
• 1 材料与方法18-27
• 2 结果27-30
• 3 讨论30-33
• 4 小结33-34
• 参考文献34-36
• 文献综述：细胞因子在结核病中的研究进展以及结核菌的持留机制36-47
• 参考文献43-47
• 致谢47-48
• 读研期间发表论文48

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本文编号：438789