产气荚膜梭菌NetB毒素阻断ELISA方法的建立与应用

发布时间：2017-06-10 21:07

  本文关键词：产气荚膜梭菌NetB毒素阻断ELISA方法的建立与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：产气荚膜梭菌(CP)是一种重要的人兽共患病病原体,广泛分布于自然界,可导致多种动物发生坏死性肠炎、肠毒血症以及人类的气性坏疽和食物中毒。迄今为止,已研究发现该菌能产生15种外毒素。NetB毒素是首次在坏死性肠炎(NE)病鸡体内分离的A型CP中发现的,NetB毒素在禽类NE的发病机制中是一种关键的致病因子。因此,研究该毒素蛋白的生物学功能及检测方法对CP的诊断和防治有重要的意义。本文将CP NetB毒素蛋白表达产物经切胶纯化和复性后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blot方法对所制备的抗体进行检测。结果显示多抗血清效价达到1:32768,且重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性。将实验室保存的4株抗NetB毒素杂交瘤细胞株复苏并进行生物学活性分析,选择反应性好的单克隆抗体(McAb)F9G3株腹腔接种BALB/c小鼠成功进行了腹水的制备。以纯化的CP重组NetB蛋白、兔抗CP NetB蛋白多抗和F9G3 McAb经三因素优化建立了检测CP抗体的阻断ELISA方法。优化后结果显示抗原最佳包被浓度为0.5μg/100μL,包被时间为4℃过夜;最佳封闭液为1%BSA,时间为37℃作用2 h;待检血清的作用时间为1.5 h;单克隆抗体的最佳工作浓度为0.0625μg/100μL,时间为37℃作用1 h;酶标抗体最佳稀释度为1:5 000,时间为37℃孵育1 h;最佳显色液作用时间为10 min。通过对90份CP阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥31.88%时为阳性,PI≤22.08%时为阴性,22.08%PI31.88%时为可疑。通过敏感性、特异性和重复性试验等证明此检测方法敏感性高、特异性强、可重复性好。通过对免疫鸡血清抗体效价消长规律的检测证明该方法的可靠性和准确性。利用此方法对342份临床血清样品进行检测,共有12份样品为CP NetB毒素抗体阳性,说明黑龙江省鸡场中存在产生NetB毒素的CP感染。
【关键词】：产气荚膜梭菌 NetB毒素 多克隆抗体 阻断ELISA 应用
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-10
• 1 前言10-17
• 1.1 不同类型产气荚膜梭菌研究进展10-11
• 1.1.1 A型产气荚膜梭菌10-11
• 1.1.2 B、C、D型产气荚膜梭菌11
• 1.1.3 E型产气荚膜梭菌11
• 1.2 鸡坏死性肠炎概述11-14
• 1.2.1 α 毒素与坏死性肠炎12
• 1.2.2 NetB毒素与坏死性肠炎12
• 1.2.3 鸡坏死性肠炎流行病学12-13
• 1.2.4 鸡坏死性肠炎发病诱因13
• 1.2.5 鸡坏死性肠炎临床症状和病理变化13-14
• 1.2.6 鸡坏死性肠炎的防治14
• 1.3 产气荚膜梭菌的诊断技术14-16
• 1.3.1 病原学诊断方法14
• 1.3.2 分子生物学诊断方法14-15
• 1.3.3 血清学诊断方法15-16
• 1.4 研究目的和意义16-17
• 2 材料与方法17-30
• 2.1 试验材料17-20
• 2.1.1 试验动物和细胞17
• 2.1.2 菌株、质粒及血清17
• 2.1.3 主要分子生物学试剂17
• 2.1.4 主要试剂的配制17-20
• 2.1.5 仪器设备20
• 2.2 试验方法20-30
• 2.2.1 抗原制备20-23
• 2.2.2 多克隆抗体制备和生物活性鉴定23-24
• 2.2.3 单克隆抗体腹水制备和生物学活性鉴定24-25
• 2.2.4 阻断ELISA方法的建立25-27
• 2.2.5 阻断ELISA方法的特异性试验27-28
• 2.2.6 阻断ELISA方法的灵敏度试验28
• 2.2.7 阻断ELISA方法的重复性试验28
• 2.2.8 重组NetB蛋白免疫鸡血清抗体效价动态变化检测28
• 2.2.9 阻断ELISA方法对临床样品的检测28-29
• 2.2.10 数据统计29-30
• 3 结果30-44
• 3.1 重组NetB蛋白的诱导表达30-31
• 3.2 多克隆抗体的制备及鉴定31-32
• 3.2.1 NetB多克隆抗血清的效价测定31-32
• 3.2.2 多克隆抗体的Western blot检测32
• 3.3 单克隆抗体腹水的制备和生物学活性鉴定32-34
• 3.3.1 腹水的纯化32
• 3.3.2 单克隆抗体浓度和效价的测定32-34
• 3.4 阻断ELISA方法的建立与应用34-44
• 3.4.1 阻断ELISA方法的优化34-40
• 3.4.2 阻断ELISA方法的临界值的确定40
• 3.4.3 阻断ELISA方法的灵敏性的试验40
• 3.4.4 阻断ELISA方法的特异性试验40-41
• 3.4.5 阻断ELISA方法的重复性试验41
• 3.4.6 重组NetB蛋白免疫鸡血清抗体效价动态变化检测41-42
• 3.4.7 阻断ELISA方法对临床样品的检测42-44
• 4 讨论44-47
• 4.1 腹水的制备与纯化44
• 4.2 阻断ELISA方法的建立44
• 4.3 阻断ELISA方法条件的优化44-45
• 4.4 阻断ELISA方法特异性试验45
• 4.5 阻断ELISA方法的应用45-47
• 5 结论47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-54
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王海军;芮艺;鲍萍;;肉鸡小肠球虫病继发坏死性肠炎的诊治[J];甘肃畜牧兽医;2009年01期

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本文编号：439884