兔尿源性干细胞的分离培养、鉴定及其生物学特性的研究

发布时间：2017-06-27 09:11

  本文关键词：兔尿源性干细胞的分离培养、鉴定及其生物学特性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞基础疗法为尿道组织重建提供了有前景的选择。有研究发现人尿液中存在着一种干细胞,后被定义为尿源性干细胞(USCs),这种干细胞具有较强的增殖能力,遗传稳定性好,并可有效分化为尿路上皮细胞和平滑肌细胞,且尿源性干细胞的获取简便、无创、成本低廉,这些优点为尿路的组织工程重建提供了理想的种子细胞。在相关的研究中,发现USCs能促进无胸腺裸鼠肾脏、阴茎海绵体及尿道括约肌等组织的再生。然而,因小鼠体型过小,并不适宜作为尿道重建研究的动物模型。通过查阅文献发现,新西兰大白兔是研究尿道重建的常用动物模型。为避免因异种细胞移植引起排斥反应的发生,因此有必要采用自体干细胞进行尿道组织重建研究。然而兔尿液中是否存在干细胞,且能否进行分离后培养,目前还没有相应的研究报告。目的：证实兔尿液中存在尿源性干细胞(rabbit Urine-derived Stem Cells, rUSCs),并诱导其分化为尿路上皮细胞及平滑肌细胞,为后续下尿路组织重建的研究提供种子细胞。方法：通过采用F8双腔导尿管导尿术收集6只成年雄性新西兰大白兔(体重介于2.0-2.5kg)尿液。采用离心分离法分离尿源性干细胞,经贴壁筛选法纯化细胞,KSFM和EFM混合培养基外体培养扩增。光镜下观察细胞形态；绘制细胞生长曲线；测定细胞增殖情况；流式细胞术鉴定细胞免疫表型；并诱导其向尿路上皮细胞和平滑肌细胞分化。结果：从14份兔子尿液样本中,成功的分离并培养出尿源性干细胞,每30ml兔子尿液中约有1-2个细胞克隆,在形态上rUSCs呈“米粒状”。rUSCs的细胞倍增数量(PD)和平均倍增时间(DT)分别是48.5±6.2和(25.7±8.4)h；单个rUSC克隆在(51.6士0.5)天内可增殖至4×1014个细胞(248.5=3.98×1014)；细胞生长曲线呈正常的细胞增殖模型——“S”型；流式细胞检测显示,rUSCs在p3时CD29, CD90和CD105呈阳性表达,而CD31、CD34和CD45表达呈阴性；当诱导表皮生长因子(EGF)加入培养基培养,rUSCs可诱导分化为“鹅卵石”样的细胞,特异性表达上皮细胞蛋白,如AE1/AE3:当诱导平滑肌分化的生长因子TGF-β1和PDGF-BB加入培养基培养时,rUSCs分化为“纺锤状”样的细胞,表达平滑肌特异蛋白,如α-SMA、Desmin和Myosin。结论：根据课题组初步的实验数据分析显示,兔尿液中存在USCs,且易于在体外分离和培养,并拥具有很强的增殖能力,能够被诱导分化为尿路上皮细胞和平滑肌细胞。因此,rUSCs在兔子模型中,可以作为一种潜在的自体干细胞来源,用于尿道缺损的重建和膀胱功能的修复。
【关键词】：干细胞 组织工程 尿液 尿道
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 引言9-10
• 第一章 实验材料及方法10-25
• 一、兔尿液的收集及尿源性干细胞的分离培养10-12
• 1. 材料10-11
• 2. 实验方法11-12
• 2.1 尿源性干细胞混合培养基的配制11
• 2.2 兔尿液的收集11-12
• 2.3 兔尿源性干细胞的分离及原代培养12
• 2.4 兔尿源性干细胞的传代培养12
• 二、兔尿源性干细胞生长曲线及增殖情况的测定12-14
• 1. 材料12-13
• 2. 实验方法13-14
• 2.1 细胞生长曲线的绘制13
• 2.2 细胞倍增数及倍增时间13-14
• 三、兔尿源性干细胞表面标志物的流式测定14-15
• 1. 材料14-15
• 2. 实验方法15
• 2.1 不同含量BSA的配制15
• 2.2 流式细胞测定15
• 四、尿源性干细胞多潜能分化15-18
• 1. 材料15-16
• 2. 实验方法16-18
• 2.1 兔膀胱平滑肌细胞的原代培养16-17
• 2.2 兔膀胱上皮细胞的原代培养17
• 2.3 兔膀胱平滑肌细胞和上皮细胞的传代培养17-18
• 2.4 上皮分化诱导培养基的配制18
• 2.5 平滑肌分化诱导培养基的配制18
• 2.6 兔尿源性干细胞的多潜能分化(上皮分化和平滑肌分化)18
• 五、尿源性干细胞诱导分化结果的鉴定18-25
• 1. 材料18-20
• 2. 实验方法20-25
• 2.1 细胞爬片前的处理20
• 2.2 细胞爬片20-21
• 2.3 尿源性干细胞诱导分化后细胞的免疫荧光鉴定21-22
• 2.4 Western Blot测定细胞相关蛋白表达22-25
• 第二章 实验结果25-33
• 一、兔尿液的收集及尿源性干细胞的分离培养25-27
• 二、兔尿源性干细胞生长曲线及增殖情况27-29
• 三、表面标志物的流式测定结果29-30
• 四、兔尿源性干细胞多潜能分化(上皮分化和平滑肌分化)30-31
• 五、兔尿源性干细胞诱导分化细胞的鉴定31-33
• 第三章 讨论33-36
• 结论36
• 参考文献36-39
• 文献综述39-51
• 参考文献45-51
• 附录Ⅰ51-52
• 研究生期间科研情况52-53
• 致谢53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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  本文关键词：兔尿源性干细胞的分离培养、鉴定及其生物学特性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：489230