利用大肠杆菌合成糖蛋白并对糖链长短的调节进行初步探索

发布时间：2017-07-05 22:12

  本文关键词：利用大肠杆菌合成糖蛋白并对糖链长短的调节进行初步探索

  更多相关文章： 糖蛋白 O抗原 wzz基因 同源重组

【摘要】：脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外璧层中特有的一种化学成分,由类脂A(内毒素)、核心多糖和O抗原三部分组成。O抗原由多个结构相同的重复糖单位构成,属于多糖抗原。根据糖链的长短,一般可将O抗原划分为long型(19-25个重复糖单位)、intermediate型(10-18个重复糖单位)和short型(10个重复糖单位)三种类型。不同菌株的O抗原,糖重复单位个数有所差别,构成重复糖单位的单糖个数、单糖种类及糖苷键的类型也有较大差异。脂多糖能够刺激人体的免疫系统,引起机体产生一系列的免疫反应。鉴于脂多糖在机体免疫中的重要作用,利用病原菌的脂多糖尤其是O抗原可以进行糖疫苗的研发。O抗原糖链的大小与致病菌的抗原性密切相关。O抗原位于细菌表面,能够影响部分分泌蛋白的功能,进而影响细菌的毒力。O抗原与细菌的致病性密切相关,在细菌信号识别、黏附、免疫逃避等过程中发挥着重要作用。对于致病菌而言,O抗原糖链越长,对血清的耐受性就越强。根据合成机制(主要指反转酶)的不同,O抗原的合成可划分为三种,分别为依赖Wzy的合成途径、依赖于ABC运转器的合成途径和依赖于合成酶的合成途径。Wzy依赖机制中存在一种重要的调节蛋白Wzz,负责0抗原糖链长短的调节。在Wzz的作用下,O抗原糖链具有一定的大小特异性。通过Wzz蛋白对O抗原糖链的大小进行改造可改变O抗原的抗原性,进而开发具有特定效力的糖疫苗。随着细菌N-糖基化系统的发现,O抗原与免疫蛋白载体在细菌中结合成为了可能。本论文第二章主要是关于糖蛋白生物合成的研究,糖蛋白中的糖成分来自于E. coli O157:H7的O抗原。首先,利用Red同源重组系统对E. coli W3110菌株的waal基因进行敲除；其次,构建了含有E. coli O157:H7 O抗原基因簇的载体pYES1L-O157 rfp;MBP作为疫苗的受体蛋白时,其本身具有结合(Toll-like receptor 4)TLR4的能力,并促进细胞因子的活化,激活人体的抗原呈递细胞-树突状细胞,激发人体特异的免疫应答和免疫记忆,MBP表达量大,易于纯化及验证。基于MBP的上述优点,选择该蛋白作为PglB催化的N-糖基化途径的受体蛋白。为了提高糖基化的效率,将pglb基因和C末端加入了4个连续DQNAT糖基化位点的mbp基因克隆到pBAD24载体中。最后,构建了糖蛋白的表达菌株并进行糖蛋白的纯化,对纯化的蛋白进行了Western blot验证及MALDI-TOF-MS验证。与目前的化学交联方法相比,利用生物学方法获得的糖-蛋白缀合物疫苗具有高均质性、无污染、一次发酵、便于纯化等优点,具有化学方法不可比拟的优势。本论文第三章主要是关于糖蛋白糖链长短的研究,通过糖链的长短来调解糖蛋白的免疫原性。首先,利用Red同源重组系统对E.coli W3110Awaal菌株的wzz基因进行敲除；其次,跟据O抗原糖链大小,选择了E.coli O111(长),E. coli 0127(长)和E. coli O86:H2(中)菌株的wzz基因进行克隆,分别构建到pEXT22载体上；第三,利用同源重组技术可以对E.coli O157:H7O抗原的基因簇进行克隆,该基因簇中不包含wzz基因。最后,分别构建表达不同糖链长短糖蛋白的菌株并进行糖蛋白的纯化。
【关键词】：糖蛋白 O抗原 wzz基因 同源重组
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 符号说明15-17
• 第一章 绪论17-37
• 1.1 糖类概述18-20
• 1.1.1 糖的定义及分类18
• 1.1.2 细菌多糖18-19
• 1.1.3 大肠杆菌脂多糖19-20
• 1.2 大肠杆菌O抗原20-25
• 1.2.1 大肠杆菌O抗原的结构20-21
• 1.2.2 大肠杆菌合成O抗原的基因簇21-22
• 1.2.3 大肠杆菌O抗原的合成过程22-23
• 1.2.4 Wzz简介23-25
• 1.3 N-连接糖基化系统25-28
• 1.3.1 真核生物N-连接糖基化25-26
• 1.3.2 原核生物中N-连接糖基化26-27
• 1.3.3 细菌的寡糖基转移酶PglB27-28
• 1.4 同源重组技术28-31
• 1.4.1 同源重组技术简介28
• 1.4.2 基因敲除的一般步骤28-29
• 1.4.3 同源重组在克隆技术上的应用29-31
• 1.5 糖类疫苗的研究31-33
• 1.5.1 多糖疫苗31-32
• 1.5.2 糖蛋白结合疫苗32-33
• 1.6 糖蛋白的合成33-37
• 1.6.1 糖蛋白的化学合成法33
• 1.6.2 糖蛋白的生物合成法33-37
• 第二章 糖蛋白的生物合成37-53
• 2.1 引言37-38
• 2.2 实验材料38-40
• 2.2.1 菌株和载体38
• 2.2.2 酶和耗材38-39
• 2.2.3 培养基与缓冲液39-40
• 2.2.4 仪器设备40
• 2.3 实验方法40-46
• 2.3.1 利用Red同源重组进行基因敲除40-42
• 2.3.2 载体构建42-43
• 2.3.3 表达菌株的构建及糖蛋白的纯化43-46
• 2.4 实验结果与讨论46-52
• 2.4.1 基因敲除菌株E.coli W3110△waal的构建46
• 2.4.2 载体蛋白及糖基转移酶基因的克隆46-48
• 2.4.3 载体pYESIL-O157 rfb的构建48
• 2.4.4 表达菌株的构建及糖蛋白的纯化48-50
• 2.4.5 糖蛋白的Western blot验证50-51
• 2.4.6 糖蛋白的质谱分析51-52
• 2.5 本章小结52-53
• 第三章 糖蛋白糖链长短调节的初步探索53-67
• 3.1 引言53-54
• 3.2 实验材料54-55
• 3.2.1 菌株和载体54
• 3.2.2 酶和耗材54
• 3.2.3 仪器设备54-55
• 3.2.4 培养基与缓冲液55
• 3.3 实验方法55-61
• 3.3.1 利用Red同源重组进行基因敲除55-56
• 3.3.2 载体构建56-57
• 3.3.3 利用RedE/T技术直接克隆大片段57-59
• 3.3.4 利用同源重组技术对载体进行修饰59-60
• 3.3.5 LPS的提取及银染60-61
• 3.4 实验结果与讨论61-66
• 3.4.1 基因敲除菌株E. coli W3110△waal△wzz的构建61-62
• 3.4.2 不同来源wzz基因的克隆62
• 3.4.3 E. coli O157：H7O抗原基因簇的构建(不含wzz基因)62-64
• 3.4.4 p15A-157 antigen载体的表达验证64-65
• 3.4.5 p15A-157 antigen载体的修饰65-66
• 3.5 本章小结66-67
• 全文总结67-69
• 参考文献69-77
• 致谢77-79
• 攻读学位期间发表的学术论文79-80
• 学位论文评阅及答辩情况表80

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本文编号：523794