表皮葡萄球菌agrC蛋白原核表达载体的构建及蛋白表达

发布时间：2017-07-15 16:19

  本文关键词：表皮葡萄球菌agrC蛋白原核表达载体的构建及蛋白表达

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【摘要】：[目的]研究溶葡萄球菌酶在提取表皮葡萄球菌基因组DNA中的作用,构建表皮葡萄球菌agrC原核表达载体,表达agrC蛋白,为合成以agrC为靶点治疗表皮葡萄球菌生物膜形成相关感染的特异性多肽药物奠定基础。[方法]对传统酶解法进行改良,加入溶葡萄球菌酶与溶菌酶共同破壁,比较不同剂量溶葡萄球菌酶提取表皮葡萄球菌基因组DNA的效果,提取表皮葡萄球菌成膜阳性标准株RP62a基因组DNA;采用PCR技术扩增出agrC基因片段,采用T-A克隆技术构建agrC重组克隆载体；使用pET28a(+)质粒构建agrC原核表达载体,利用IPTG诱导agrC蛋白表达；采用PCR、双酶切反应及引物测序法对重组克隆载体和原核表达载体进行验证,采用western blot技术鉴定agrC蛋白。[结果]溶葡萄球菌酶与溶菌酶共同孵育可提高表皮葡萄球菌基因组DNA浓度,并且浓度在一定程度上随溶葡萄球菌酶剂量的增加而增加,获得了表皮葡萄球菌agrC基因片段(约1290bp);构建pMD-agrC重组克隆载体,构建pET28a(+)-agrC原核表达载体,表达出agrC蛋白(约43KD)。[结论]在传统酶解法中加入溶葡萄球菌酶可协助表皮葡萄球菌破壁;能提高表皮葡萄球菌基因组DNA提取效率；通过T-A克隆技术构建agrC重组克隆载体可稳定有效的保存agrC基因,pET原核表达系统可在IPTG诱导下成功表达完整的agrC蛋白。
【关键词】：表皮葡萄球菌 agrC 细菌生物膜 生物材料植入感染 原核表达
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.11
【目录】：

• 缩略词表8-10
• 中文摘要10-11
• 英文摘要11-13
• 前言13-16
• 材料16-21
• 菌株和质粒16
• 试剂16-17
• 主要仪器设备17-18
• 主要溶液和试剂配制18-21
• 方法及步骤21-33
• 改良酶解法提取表皮葡萄球菌RP62a基因组DNA21-23
• 采用PCR技术扩增表皮葡萄球菌agrC基因23-25
• 采用T-A克隆法构建agrC基因的重组克隆载体25-29
• 使用pET28α(+)表达质粒构建agrC重组蛋白原核表达载体29-30
• 利用IPTG诱导agrC重组蛋白的原核表达30-33
• 结果33-46
• 改良酶解法提取表皮葡萄球菌RP62a基因组DNA的结果33-35
• agrC基因的PCR检测结果35
• agrC基因的T-A克隆结果35-39
• agrC基因重组表达载体构建结果39-46
• 讨论46-54
• 参考文献54-58
• 综述58-70
• 参考文献65-70
• 攻读学位期间获得的学术成果70-71
• 致谢71

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1 成鹏;表皮葡萄球菌agrC蛋白原核表达载体的构建及蛋白表达[D];昆明医科大学;2016年

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本文编号：544719