FKBP52通过FOXA1调节雌激素受体ER和雄激素受体AR的平衡

发布时间：2017-07-20 16:20

  本文关键词：FKBP52通过FOXA1调节雌激素受体ER和雄激素受体AR的平衡

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【摘要】：第一部分 FKBP52通过FOXA1调节雌激素受体ER和雄激素受体All的平衡[目的]ER与AR同属于甾体激素受体超家族的成员,其平衡对生物体正常的生长发育过程至关重要。健康女性中ER和AR的表达量相当,而一些ER和AR失衡的组织内疾病的发生率要显著高于正常组织,说明其平衡在人体稳态中的重要性。FKBP52是一种共伴侣蛋白通过参与形成激素受体复合物发挥功能。FKBP52敲除雄性小鼠存在乳腺发育的表型,前期研究发现FKBP52对ER/AR平衡产生影响,但具体的分子机制还缺乏了解。本课题通过对RNA-seq结果分析,结合免疫组化的结果,提出FKBP52可能通过FOXA1的影响ER与AR的平衡,并探究具体的分子机理。通过研究FKBP52基因敲除雄性小鼠乳腺发育的表型,对了解FOXA1在乳腺发育中及对ER和AR平衡的作用具有重要意义。[方法]1)表型分析及行为学实验。测量突变雄鼠、野生雌鼠和野生雄鼠的脚趾第二指及第四指的长度并计算比值,以及观察突变雄鼠行为学方面的改变。2)fRNA-seq测序。分离提取10天大小的突变雄鼠、野生雌鼠的乳头和野生雄鼠相应部位皮肤组织的RNA,测序筛选得到一些影响乳腺发育的基因；通过对测序数据的分析找到可能影响乳腺发育的信号通路。3) Real-time PCR验证。将用作测序的同一批次的RNA逆转录成cDNA,通过Real-time PCR以验证ER、AR以及一些变化较大的影响乳腺发育的基因的表达情况。4)免疫组化实验。对相关基因在乳腺中的表达分布情况进行检测。5)体外细胞实验。小鼠MEF细胞中检测FKBP52、FOXA1、ERα的表达情况,人的乳腺癌细胞系中通过干扰和过表达FKBP52基因的表达检测FOXA1的变化。6)放线菌酮(CHX)检测蛋白稳定性。7)Co-IP实验。探究FKBP52与FOXA1在蛋白水平的相互作用。[结果]1)突变雄鼠表型区别于野生雄鼠指长比2D:4D≥1,并且行为学实验结果显示突变雄鼠倾向于待在雄鼠用过的垫料内,这一选择与野生雌鼠相似；综上突变雄鼠表现出雌性化特征；2)RNA测序结果显示突变雄鼠基因表达谱与野生雌鼠基本一致,FOXA1、CITED1、wnt5a、Col4a2、 sox-15、sox-7、krt6-b、 Ihh、btc、Igfbp2基因发生明显变化；3)Real-time验证结果与测序结果相同；4)免疫组化实验结果发现在FKBP52敲除雄鼠乳腺中ERa表达上升,同时ERa的表达趋势与FOXA1非常相近；5)FKBP52敲除的小鼠MEF细胞FOXA1表达缺失,ERa表达上调,而在野生的MEF细胞中过表达FKBP52发现FOXA1表达降低的现象,说明FKBP52与FOXA1之间存在极强的调控关系,而雌激素处理实验也证明了FKBP52对FOXA1的调控依赖于ER。而在ER(+)的人乳腺癌细胞系MCF-7 和 ER (-)的 SK-BR-3中通过干扰和过表达FKBP52基因,发现在ER(+)的MCF-7细胞内降低FKBP52的表达会造成FOXA1升高,过表达FKBP52后FOXA1表达降低,而在ER(-)的SK-BR-3细胞则没有观察到这种变化,同样说明FKBP52和FOXA1在细胞内存在直接调控关系,并且这种调控依赖雌激素受体ER；6)放线菌酮处理(CHX)实验揭示FKBP52降低后FOXA1蛋白稳定性增强；7)Co-IP实验显示FKBP52和FOXA1在蛋白水平存在直接的相互作用。[结论]在FKBP52基因敲除雄鼠中,FKBP52的缺失造成了FOXA1蛋白稳定性增强,进而影响了FOXA1的表达导致下游ER活性的增强并最终改变ER/AR间的平衡,这可能是产生雄鼠乳腺异常发育现象的原因。第二部分 一种gRNA快速合成及检测方法的建立[目的]建立一种gRNA快速合成及体外检测的方法。[方法]设计引物并利用PCR技术迅速扩增gRNA的DNA模板片段,然后通过体外转录纯化得到gRNA；最后通过体外反应迅速对gRNA和Cas9酶切效率及特异性进行检测。[结果]体外合成的gRNA特异性强,活性高,在靶点上成功切开DNA双链。[结论]成功建立gRNA快速合成及检测的方法,为后续转染或显微注射筛选有活性gRNA节约了时间。
【关键词】：FKBP52敲除 FOXA1 ER AR 乳腺发育 CRISPR/Cas9 PCR扩增 体外转录 体外检测
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R33
【目录】：

• 第一部分：FKBP52通过FOXA1调节雌激素受体ER和雄激素受体AR的平衡4-49
• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-20
• 材料和方法20-33
• 材料20-23
• 实验方法23-33
• 实验结果33-46
• 讨论46-49
• 第二部分：一种gRNA快速合成及检测方法的建立49-59
• 摘要49
• Abstract49-50
• 前言50-51
• 实验材料51-52
• 实验方法52-53
• 实验结果53-58
• 讨论58-59
• 英文缩略表59-60
• 参考文献60-68
• 致谢68-69
• 个人基本情况69-70
• 硕士期间论文发表情况及学术表现70-71

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本文编号：568930