SAMHD1蛋白的抗病毒功能研究

发布时间：2017-07-26 11:11

  本文关键词：SAMHD1蛋白的抗病毒功能研究

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【摘要】：SAMHD1是近年来新发现的抗艾滋病毒的天然蛋白质分子,在髓系来源的树突细胞、巨噬细胞和静息CD4+T细胞中,发挥dNTPase功能,通过降低胞内dNTP水平,阻止HIV-1病毒早期复制。此外,HIV-2和一些SIV编码的Vpx蛋白,可以通过加载SAMHD1到CRL4DCAF1E3泛素连接酶上诱导SAMHD1蛋白酶体降解,通过降解SAMHD1促进HIV-1反转录产物cDNA的积累,明显促进人的单核细胞及其来源的树突细胞和巨噬细胞的感染。本研究在前期研究的基础上,进一步探索了恒河猴中不同SNP位点的SAMHD1蛋白的抗病毒功能、CEMx174细胞中SAMHD1蛋白表达与SIVmac239病毒水平的相关性以及SHIVsF162P3感染恒河猴体内samhdl mRNA的变化等,以期进一步完善对SAMHD1蛋白抗病毒功能的认知。第一部分：不同SNP位点的SAMHD1蛋白的抗病毒功能的研究。前期在中国恒河猴中对SAMHD1蛋白进行了大样本筛查,共筛查出5个非同义cSNP位点,均在群体中占有较高的频率。其中G183S、E184D、V280A分布在具磷酸水解酶活性的HD结构域上；S107L分布在参与蛋白-蛋白或蛋白-RNA相互作用的SAM结构域上。用软件对这5个SNP位点的SAMHD1二级、三级结构和功能影响进行了预测分析。发现了其中G183S、E184D、V280A这三个位点最有可能影响蛋白质的功能和结构,在二级结构上,这三个位点所处的HD结构域发生了一个cc螺旋到p片层的转变,一个蛋白质结合位点也因为这三个cSNP的出现而发生了移位；在三级结构上,V280A正好处于蛋白质活性中心(凹槽部位)的袋口处,类似于盒盖的结构上,可能会影响到SAMHD1的磷酸水解酶催化活性。S107L位于SAMHD1敏感性的位点,可能影响病毒Vpx蛋白结合,说明此位点也有较大可能会改变蛋白质的功能。D5E未分布于重要的蛋白结构域上,目前还没有能改变蛋白功能的证据支持,但也有文献报道,SAMHD1蛋白的N端能够与艾滋病毒相互作用,所以有待进一步的实验验证。本研究中,我们分别使用5种SNP位点突变的samhdl表达载体转染TZM-bl细胞,再用转染后的细胞滴定HIV假病毒和SIV的病毒滴度,以验证5种SNP位点突变的SAMHD1蛋白抗病毒功能的大小。结果表明,不同SNP位点的SAMHD1蛋白的抗HIV病毒作用确实有些不同。其中,D5E、G183S、V280A三个位点突变的samhd质粒转染后与对照标准的samhd1质粒转染后的的病毒滴定结果一致；S107L位点的突变使得TCID50的值比对照降低了10倍,发挥了比其他5个位点突变更高的抗病毒作用；E184D位点的突变,测出的TCID50的值比对照TZM-b1细胞的值高,说明转染进入细胞的基因可能没有发挥抗病毒功能反而还影响了正常细胞内的抗病毒蛋白发挥作用。与之相反,分别用转染六种不同samhd1基因的TZM-b1细胞滴定SIVmac239病毒得到的TCID50的值都是一样的。说明不同SNP的SAMHD1蛋白抗SIVmac239的作用差异较小,对病毒的最终滴度影响不大。这应该与SIVmac239编码的Vpx蛋白有关。这也说明,由于SIV病毒中Vpx蛋白的存在,SIV感染恒河猴不同个体间出现的疾病进程的差异应该与恒河猴体内的SAMHD1蛋白没有太大关系,更与SAMHD1蛋白的不同的SNP位点无关。第二部分：CEMx174细胞中SAMHD1蛋白表达与SIVmac239病毒水平的相关性研究。SAMHD1蛋白作为限制因子,在髓系树突细胞、巨噬细胞和静息CD矿T细胞中,发挥dNTPase功能,通过降低胞内dNTP水平,阻止HIV-1病毒早期复制,但在感染的活化CD4+T细胞中,是否发挥抗病毒作用却知之甚少。本研究中,CEMx174细胞感染SIVmac239病毒后,随着培养上清中的病毒载量快速升高,细胞中病毒P27蛋白的表达水平也增加迅速。而samhd1的mRNA相对表达量在4天后显著增加,与病毒载量呈正相关,可见细胞在感染过程中,上调了samhd1基因的表达；与之相反的是细胞中SAMHD1蛋白表达量从4天后逐渐下降,第5-6天时基本检测不到,与SIV病毒P27蛋白量呈显著负相关。SAMHD1蛋白表达量的降低,可能与SIVmac239病毒产生的Vpx蛋白降解SAMHD1蛋白有关。SAMHD1蛋白在活化的细胞中是否发挥抗病毒的功能有待进一步证实,但本研究中发现感染SIV的CEMx174细胞samhd1基因上调,蛋白含量下降,说明SAMHD1在感染过程中是起作用的。广谱表达的SAMHD1蛋白可能具有广谱的抗病毒作用,不只是在静息CD4+T细胞或髓系细胞中发挥作用。第三部分：SHIVsF162P3感染恒河猴体内samhd1 mRNA表达量的变化。在SIV病毒感染的恒河猴研究中,Bianka Mubi1等人发现,在缓慢进展型疾病进程中以及病毒载量水平较低的恒河猴体内,同SAMHD1同样具有抗病毒作用的APOBEC3G(A3G)和APOBEC3F (A3F)蛋白在mRNA水平上表达量是增加的。那么, SAMHD1蛋白在SIV/SHIV感染猴体内,在mRNA水平上的表达量是否随着病毒载量的变化也会有所变化?是否在恒河猴体内发挥抗病毒的功能?本研究以SHIVSF162p3病毒静脉感染4只中国恒河猴,均成功感染,其中一只表现出快速进展型疾病特征。我们首先利用相对定量的方法检测了感染恒河猴外周血PBMC细胞中的samhd1基因相对于内参基因gapdh表达量的变化。发现除了快速进展型的G0822V外,其余3只恒河猴的samhd1 mRNA水平均随着病毒载量的升高而升高；快速进展型的G0822V-P正好相反,伴随着始终高水平的病毒载量,水平反而呈现向下波动的趋势。我们认为,samhd1 mRNA表达量可能与疾病进程相关,快速进展型及高水平病毒载量下调samhd1基因的表达。为了更直观地显示表达量的变化,本研究中我们还建立了用标准品实时荧光定量检测samhd1基因mRNA水平的方法。研究中发现,在感染急性期病毒载量增加的过程中,samhdl mRNA表达水平均略有下降,急性期后伴随着载量的降低又恢复到正常水平。由此我们认为,虽然SAMHD1是抗病毒蛋白分子,但在病毒感染的过程中,细胞可能下调了该类蛋白的表达。至于下调的原因,是由于机体本身还是由于病毒感染导致的,机制尚不明确。另外,由于目前明确SAMHD1蛋白抗病毒功能的单核细胞、单核来源的巨噬细胞等同时也是SHIVSF162P3病毒攻击的靶细胞,其感染后或死亡或被诱导凋亡,都会导致靶细胞数量的减少,从而导致检测的mRNA水平的降低。
【关键词】：SAMHD1 HIV SIV
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51;R3411
【目录】：

• 主要英文缩写词4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分 不同SNP位点的恒河猴SAMHD1蛋白的抗病毒功能的研究14-46
• 第一节 引言14-15
• 第二节 实验材料15-21
• 第三节 实验方法21-34
• 第四节 实验结果34-44
• 第五节 讨论44-46
• 第二部分 CEMx174细胞中SAMHD1蛋白表达与SIVmac239病毒水平的相关性研究46-59
• 第一节 引言46-47
• 第二节 实验材料47-51
• 第三节 实验方法51-55
• 第四节 实验结果55-58
• 第五节 讨论58-59
• 第三部分 SHIV_(SF162P3)感染恒河猴外周血PBMC中samhd1 mRNA的变化59-75
• 第一节 引言59-60
• 第二节 实验材料60-63
• 第三节 实验方法63-68
• 第四节 实验结果68-74
• 第五节 讨论74-75
• 第四部分 总结75-77
• 参考文献77-81
• 致谢81-83
• 个人基本情况83-84
• 硕士期间论文发表情况84-85

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1 彭灵娟;SAMHD1蛋白的抗病毒功能研究[D];北京协和医学院;2016年

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本文编号：576081