抗CD47纳米抗体的制备和鉴定

发布时间：2017-07-29 13:16

  本文关键词：抗CD47纳米抗体的制备和鉴定

  更多相关文章： 食管癌细胞 CD47 纳米抗体 抗体靶向治疗 噬菌体展示

【摘要】：CD47是一种广泛表达的膜蛋白,也称为整合素相关蛋白(IAP)。作为巨噬细胞和髓样细胞表面的信号调节蛋白α(Signal regulatory protein alpha,SIRPα)的配体,其与SIRPα的相互作用,对吞噬细胞提供了负调控信号,抑制了巨噬细胞的吞噬作用。近年来,发现CD47在白血病、淋巴瘤和几乎所有实体瘤中均高表达,CD47-SIRPα信号的激活抑制了吞噬细胞对肿瘤的清除作用,成为肿瘤逃逸免疫监视的机制之一。采用抗体或拮抗剂阻断CD47-SIRPα信号通路,从而恢复免疫细胞功能,成为抗肿瘤免疫治疗的新策略。食管癌是新疆地区高发癌症之一,其对常规化疗具有耐药性并且预后不良,需要发展新的治疗策略。目前,还没有研究报道食管癌细胞是否表达CD47,也没有靶向CD47治疗食管癌的报道。纳米抗体是骆驼中天然缺失轻链的重链抗体的可变区片段,是目前最小的具有完全抗原结合功能的单域抗体。因其具有分子小、组织穿透能力强、易于结合蛋白裂隙表位和生产成本低等优点,已经成为开发新一代治疗抗体很有希望的候选分子。本研究的目的主要有两方面,一是通过CD47单抗对食管癌的作用,初步评价CD47作为抗食管癌细胞作用靶点的价值;另一方面是建立双峰驼天然VHH噬菌体文库,通过噬菌体展示技术,筛选和获得抗CD47纳米抗体,为今后开展纳米抗体抗肿瘤作用研究提供基础。本研究主要包括以下两部分内容:1.抗CD47单克隆抗体对体外食管癌细胞的抗肿瘤作用研究首先采用RT-PCR、流式细胞术、Western-Blot和细胞免疫荧光等检测食管癌细胞表面CD47的表达。其次,采用小鼠巨噬细胞体外吞噬实验检测抗CD47单克隆抗体(B6H12)对食管癌的抗肿瘤作用。采用CFSE对食管癌细胞进行荧光标记。食管癌细胞增殖和凋亡分别采用CCK-8和Annexin V-FITC用流式细胞仪检测。结果表明,所有检测的食管癌细胞与Vero细胞相比CD47表达差异显著;其中ec9706和kyse150细胞cd47的表达显著高于eca-109细胞。对ec9706和kyse150进行的细胞增殖和吞噬实验结果显示,抗cd47单抗(b6h12)处理后的细胞系,细胞增殖受到明显的影响,与igg1同种型抗体相比,差异显著(p0.05)。将小鼠巨噬细胞与cfse标记的ec9706和kyse150细胞共孵育,抗cd47单抗(b6h12)与igg1同种型抗体相比,小鼠巨噬细胞对食管癌细胞ec9706和kyse150的吞噬作用明显增强,差异极显著(p0.01),且吞噬指数达0.2。这些结果表明食管癌细胞系(ec9706和kyse150)高表达cd47,抗cd47单抗能够促进巨噬细胞对所研究的食管癌细胞的吞噬作用,为靶向cd47治疗食管癌提供依据。2.噬菌体展示技术筛选和鉴定抗cd47纳米抗体首先采用dna重组技术制备cd47蛋白。以人cd47基因全长cdna克隆为模板,pcr扩增cd47胞外区基因片段,构建pet30a-cd47重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达经镍离子纯化,利用抗cd47单抗进行鉴定。将纯化蛋白对新疆双峰驼进行免疫,获得骆驼抗cd47蛋白的多克隆抗体,用于分析抗体对cd47蛋白的结合情况。其次,采用噬菌体展示技术制备纳米抗体。从采自5头骆驼的外周淋巴细胞中提取rna反转录cdna为模板扩增vhh基因片段,经过psti/noti双酶切后连接到pmecs载体上,电转化tg1大肠杆菌细胞形成vhh天然抗体文库。vhh噬菌体展示文库采用m13ko7辅助噬菌体超感染、扩增以及peg8000沉淀纯化获得。采用亲和淘洗方法,在elisa板上用纯化的重组cd47蛋白对噬菌体展示文库进行三轮筛选,对筛选输出的噬菌体采用多克隆噬菌体elisa测定富集指数。对辅助噬菌体感染后生长在琼脂平板上的阳性克隆,采用菌落pcr和序列测定进行鉴定。阳性纳米抗体基因序列亚克隆到原核表达载体进行诱导、表达和纯化。采用抗c-myc酶标二抗在elisa中检测纳米抗体与重组cd47抗原的结合活性和亲和力。cd47基因经过密码子优化后,经0.2mmiptg诱导,在大肠杆菌bl21(de3)菌株中获得高表达。经ni-离子亲和层析纯化后得到纯度约90%的cd47重组蛋白,并可被抗cd47单抗(b6h12)特异结合。elisa测定cd47蛋白免疫的新疆双峰驼抗血清效价可达1:200000,说明CD47蛋白在骆驼体内能激发免疫反应,为今后构建免疫文库提供基础。从骆驼外周血淋巴细胞中,采用VHH特异引物构建了库容为1.4×109cfu天然VHH纳米抗体噬菌体展示文库,从文库中随机选取91个菌落,测序分析其中有85个VHH抗体,表明文库质量较高。经过三轮亲和筛选,获得了输出量为6.0×104cfu的噬菌体,多克隆噬菌体ELISA结果表明富集指数达10。从第三轮筛选输出噬菌体感染的菌落生长的琼脂平板中随机挑取38个单克隆,进行菌落PCR鉴定和序列测定表明38个均为阳性克隆。挑选其中3个噬菌体克隆,VHH-CD47-201、VHH-CD47-204和VHH-CD47-802,亚克隆到pET30a在BL21(DE3)中进行诱导。表达的蛋白经过SDS-PAGE检测分别在25 kDa、28 kDa和21 kDa出现目的条带,与预期大小一致。纯化后得到纯度约90%的纳米抗体。间接ELISA结果表明,VHH-CD47-201重组纳米抗体能与CD47蛋白结合。本研究首次表明,CD47蛋白在本次研究的食管癌细胞系表面高表达,抗CD47单抗能够促进巨噬细胞对食管癌细胞的吞噬作用。从天然VHH噬菌体文库中可以获得具有一定结合力的抗CD47纳米抗体。该研究为进一步开展纳米抗体抗肿瘤作用打下了基础。
【关键词】：食管癌细胞 CD47 纳米抗体 抗体靶向治疗 噬菌体展示
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392;TB383.1
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 英文缩略语10-14
• 第一部分 CD47及其配体SIRPα 与肿瘤的相关性14-27
• 1 CD47的生物学作用14-16
• 1.1 CD47的基本特征14-15
• 1.2 CD47的主要配体和生物学功能15
• 1.3 CD47与T细胞之间的相互作用15-16
• 2 SIRPα 的生物学作用16
• 3 CD47和SIRPα 的表达16-17
• 4 CD47-SIRPα 相互作用及信号通路17-19
• 4.1 CD47-SIRPα 相互作用17-18
• 4.2 CD47-SIRPα 信号通路18
• 4.3 CD47- SIRPα 信号通路在肿瘤免疫逃逸中的作用18-19
• 5 靶向CD47抗肿瘤免疫治疗的研究进展19-21
• 5.1 靶向CD47的抗体作用的主要机制19-20
• 5.2 靶向CD47的抗体作用于肿瘤的选择性20
• 5.3 靶向CD47抗体肿瘤治疗的联合策略20-21
• 6 展望21
• 参考文献21-27
• 第二部分 实验研究27-86
• 第一章 抗CD47单克隆抗体可通过促进体外巨噬细胞对食管癌细胞的吞噬发挥抗肿瘤作用27-42
• 1 实验材料28-29
• 1.1 主要仪器28
• 1.2 细胞及质粒28
• 1.3 引物与试剂28
• 1.4 培养基及溶液配制28-29
• 1.5 数据分析29
• 2 方法29-33
• 2.1 食管癌细胞的培养与保存29
• 2.2 食管癌细胞中RNA的提取及c DNA的合成29-30
• 2.3 RT-PCR检测食管癌细胞系中的CD4730
• 2.4 流式细胞术检测食管癌细胞CD47因子30-31
• 2.5 食管癌细胞膜蛋白的提取31
• 2.6 Western-Blotting检测食管癌细胞系中CD47的表达31-32
• 2.7 免疫荧光检测食管癌细胞表达CD47蛋白32
• 2.8 检测抗CD47抗体对食管癌细胞的增殖影响32
• 2.9 抗CD47单抗促吞噬实验32-33
• 3 结果与分析33-39
• 3.1 食管癌细胞中RNA的提取33-34
• 3.2 RT-PCR检测食管癌细胞系中的CD4734-35
• 3.3 CD47因子在食管癌细胞的表达35
• 3.4 Western-Blotting检测食管癌细胞膜蛋白中CD47的表达35-36
• 3.5 免疫荧光检测食管癌细胞中CD4736-37
• 3.6 抗CD47单克隆抗体对食管癌细胞增殖的影响37-38
• 3.7 抗CD47单克隆抗体促吞噬实验38-39
• 4 讨论39-40
• 参考文献40-42
• 第二章 在大肠杆菌中表达、纯化和鉴定CD47胞外区重组蛋白42-57
• 1 实验材料42-44
• 1.1 菌种及质粒42
• 1.2 引物与试剂42-43
• 1.3 培养基及溶液配制43-44
• 2 实验方法44-50
• 2.1 p ET-30a-CD47重组质粒的构建44-46
• 2.1.1 引物的设计44
• 2.1.2 PCR扩增CD47基因44-45
• 2.1.3 p ET-30a质粒的制备45-46
• 2.1.4 p ET-30a质粒与CD47基因片段的连接46
• 2.1.5 连接产物的转化46
• 2.2 转化子的鉴定46-47
• 2.2.1 DH5α-p ET-30a-CD47转化子的鉴定46-47
• 2.2.2 p ET-30a-CD47重组质粒的转化及转化子的鉴定47
• 2.3 CD47蛋白的诱导表达及纯化47-48
• 2.3.1 BL21-p ET-30a-CD47诱导条件摸索47
• 2.3.2 BL21-p ET-30a-CD47大量诱导表达47-48
• 2.3.3 CD47蛋白的纯化48
• 2.4 CD47密码子优化48-49
• 2.5 Western Blot检测CD47蛋白49
• 2.6 CD47蛋白免疫新疆双峰驼49
• 2.7 免疫血清效价测定49-50
• 3 实验结果50-55
• 3.1 p ET-30a-CD47原核表达载体的构建50
• 3.2 p ET-30a-CD47的鉴定50-51
• 3.3 CD47蛋白的诱导表达及纯化51-52
• 3.4 CD47基因中稀有密码子优化结果52-53
• 3.5 密码子优化后的CD47蛋白的构建及表达纯化53-54
• 3.6 Western Blot检测CD47蛋白54
• 3.7 血清效价的测定54-55
• 4 讨论55-56
• 参考文献56-57
• 第三章 双峰驼天然VHH噬菌体展示文库的构建及抗CD47纳米抗体的筛选57-86
• 1 实验材料59-61
• 1.1 菌种及质粒59
• 1.2 试剂59
• 1.3 引物设计59-60
• 1.4 培养基及溶液配制60-61
• 2 实验方法61-67
• 2.1 VHH天然噬菌体展示文库的构建61-64
• 2.1.1 新疆双峰驼血液的采集和淋巴细胞的分离61
• 2.1.2 淋巴细胞总RNA的提取和c DNA的合成61-62
• 2.1.3 以c DNA为模板扩增VHH基因62-63
• 2.1.4 p MECS载体及VHH基因片段的酶切回收和连接63
• 2.1.5 连接产物的转化和VHH抗体库的构建63-64
• 2.1.6 VHH抗体文库的质量评估64
• 2.2 VHH噬菌体展示文库的筛选64-66
• 2.2.1 TG1大肠杆菌的扩增64
• 2.2.2 M13KO7辅助噬菌体的培养和浓缩64-65
• 2.2.3 M13KO7辅助噬菌体滴度的测定65
• 2.2.4 VHH抗体文库的表达和分离65
• 2.2.5 VHH展示文库滴度测定65-66
• 2.3 VHH噬菌体展示文库的亲和淘洗66
• 2.4 多克隆噬菌体ELISA检测VHH噬菌体克隆的富集66-67
• 2.5 重组质粒的构建67
• 2.6 ELISA检测VHH-CD47纳米抗体的抗原结合活性67
• 3 结果与分析67-83
• 3.1 VHH抗体库的构建及鉴定67-76
• 3.1.1 淋巴细胞总RNA的提取67-68
• 3.1.2 VHH基因片段的扩增68-69
• 3.1.3 VHH抗体库的构建及鉴定69-70
• 3.1.4 双峰驼抗体序列的分析70-76
• 3.2 VHH噬菌体展示文库的表达76-77
• 3.2.1 噬菌体滴度的测定76
• 3.2.2 VHH展示文库的滴度测定76-77
• 3.3 VHH展示文库的筛选及鉴定77-79
• 3.4 VHH展示文库的鉴定79-80
• 3.5 VHH-CD47纳米抗体的构建及鉴定80-83
• 3.5.1 p ET-30a-VHH-CD47原核表达载体的构建80-81
• 3.5.2 VHH-CD47纳米抗体的原核表达及纯化81-82
• 3.5.3 VHH-CD47纳米抗体的鉴定82-83
• 4 讨论83
• 参考文献83-86
• 第三部分 结论与展望86-88
• 结论86-87
• 展望87-88
• 致谢88-89
• 个人简历89
• 参与课题及发表文章89-90

【共引文献】

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