cagA和cagL对幽门螺杆菌侵袭细胞功能的影响

发布时间：2017-08-05 07:17

  本文关键词：cagA和cagL对幽门螺杆菌侵袭细胞功能的影响

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【摘要】：目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)可以侵入胃黏膜上皮细胞并在胃上皮细胞内繁殖进而参与致病作用。但幽门螺杆菌侵袭胃黏膜上皮细胞的机制尚不明确。研究已证实细胞的β1整合素可介导Hp侵入细胞,但尚不清楚细菌与侵袭相关的毒力因子。鉴于此,本研究将从已知幽门螺杆菌的Cag A和Cag L能与β1整合素结合为切入点,探究cag A和cag L两基因对Hp侵袭细胞功能的影响,旨在揭示与Hp侵袭细胞功能相关的毒力因子。方法:1、幽门螺杆菌NCTC11637cag L缺失株的构建参考NCBI Hp J99全基因组序列,设计NCTC11637cag L同源臂,将卡那霉素抗性基因(kanaR)连接到PCR扩增cag L基因两端区域产生的两个同源臂之间,而后插入p Bluescript SKⅡ(-)载体中,构建出带卡那霉素抗性标志的重组质粒。运用基因同源重组方法,将此重组质粒通过电击转化到NCTC11637中,以卡那霉素抗性基因替换cag L基因,通过卡那霉素羊血平板筛选出NCTC11637cag L缺失株,命名为NCTC11637Δcag L,传25代,经尿素酶和PCR鉴定,以证实遗传稳定性。2、AGS细胞与SGC7901细胞β1整合素表达验证采用Trizol法提取两株细胞的总RNA,通过RT-PCR获得c DNA,以此为模板PCR,对β1整合素进行m RNA水平表达验证;利用膜蛋白提取试剂盒提取两株细胞总膜蛋白,用抗β1整合素抗体进行western blot对β1整合素进行蛋白水平表达验证。3、cag A和cag L对幽门螺杆菌侵袭AGS细胞与SGC7901细胞功能的影响以NCTC11637、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A(由本实验室构建并保存)感染AGS细胞与SGC7901细胞(MOI=50,MOI为细菌数和细胞数的比值),一部分细胞于感染2h后洗涤裂解,裂解物涂布细菌培养板,培养后进行菌落计数,此为粘附细胞细菌数;另一部分细胞感染2h后,利用庆大霉素保护性侵袭实验,2h后,裂解细胞,裂解物涂布细菌培养板,培养后进行菌落计数,此为侵入细胞菌数。通过计算侵袭粘附比反映cag A和cag L对幽门螺杆菌侵袭能力的影响,侵袭粘附比=(侵入细胞菌数/粘附细胞菌数)×100%。4、cag A和cag L对幽门螺杆菌在细胞内存活时间的影响以NCTC11637、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A感染AGS细胞(MOI=50),利用庆大霉素保护性侵袭实验,以含庆大霉素25μg/ml的细胞培养液持续培养,分别在24h,36h,48h,72h,96h终止实验,进行细菌培养和菌落计数。结果:1、利用同源重组基因敲除技术成功构建了幽门螺杆菌NCTC11637 cag L缺失株NCTC11637Δcag L;经传25代,尿素酶和PCR鉴定,证明缺失突变株稳定;2、AGS细胞和SGC7901细胞均可以表达β1整合素,相对灰度值结果表明,AGS细胞β1整合素表达(6.387±2.957)高于SGC7901细胞(4.442±2.382);3、cag A和cag L对幽门螺杆菌侵袭AGS细胞与SGC7901细胞功能的影响(1)NCTC11637对AGS细胞的侵袭作用(28.285±4.646%)强于SGC7901细胞(0.194±0.038%);(2)AGS细胞中,NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵袭粘附比分别为28.285±4.646%、9.055±3.104%和9.225±0.417%,NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵袭粘附比均显著低于NCTC11637(P0.05),NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L侵袭粘附比差异无显著性;(3)SGC7901细胞中,NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵袭粘附比分别为0.194±0.038%、0.029±0.007%和0.061±0.009%,NCTC11637Δcag A的侵袭粘附比显著低于NCTC11637(P0.01),NCTC11637Δcag L的侵袭粘附比显著低于NCTC11637(P0.05)。4、NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L感染AGS细胞后,随着培养时间延长,胞内细菌数逐渐减少,NCTC11637Δcag L在胞内可存活72h,NCTC11637Δcag A和NCTC11637可存活48h。结论:1、AGS细胞和SGC7901细胞均表达β1整合素,AGS细胞β1整合素的表达量高于SGC7901细胞。2、幽门螺杆菌对AGS细胞的侵袭作用强于SGC7901细胞。3、cag A和cag L与幽门螺杆菌侵袭细胞功能相关。4、cag A和cag L缺失后幽门螺杆菌仍可在细胞内定植存活。
【关键词】：幽门螺杆菌 cagA cagL β1整合素 细胞侵袭
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 附录一 英文缩略语4-5
• 附录二 试剂配方5-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-37
• 结果37-46
• 讨论46-49
• 结论49-50
• 参考文献50-53
• 综述53-65
• 参考文献59-65
• 致谢65

【参考文献】

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本文编号：623614