一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法

发布时间：2017-08-06 10:30

  本文关键词：一种从大肠杆菌包涵体中分离纯化GST-TRAF6融合蛋白的方法

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【摘要】：利用8 mol/L尿素溶液对表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白进行变性,通过逐级稀释复性的方法对尿素溶解后的GST-TRAF6融合蛋白进行复性,将复性后的GST-TRAF6融合蛋白进一步利用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析的方法进行分离纯化,将分离纯化后的蛋白通过Western blot方法进行验证,最后利用体外泛素化反应检测经包涵体变性、复性和纯化后的GST-TRAF6融合蛋白的生物学活性。经过包涵体变性、梯度稀释复性和谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析3个步骤后纯化得到纯度达90%以上、浓度为396 ng/μL的蛋白质溶液。利用GST蛋白作为对照,经Western blot验证表明,纯化得到的蛋白确为GSTTRAF6融合蛋白。进一步利用体外泛素化反应分析其泛素连接酶活性发现,17 ng/μL浓度的GST-TRAF6融合蛋白能够以泛素分子作为底物在5 min内快速催化自由泛素链的生成。结果表明,表达在大肠杆菌包涵体中的GST-TRAF6融合蛋白经尿素变性溶解后能够成功复性并分离纯化,在溶解性改变的同时恢复了其泛素连接酶活性。为从大肠杆菌包涵体中大规模分离纯化蛋白质提供了一种新的复性方法。
【作者单位】： 天津商业大学
【关键词】： TRAF 蛋白纯化 包涵体复性 重组蛋白
【基金】：国家自然科学基金项目(81101220) 天津市应用基础与前沿研究计划项目(12JCQNJC08100) “十二五”天津市中青年骨干创新人才支持计划 天津市教委高等学校科技发展基金计划项目(20130624)
【分类号】：R392
【正文快照】： 肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumornecrosis fac-tor receptor-associated factors,TRAFs)是肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor,TNF)超家族和Toll样/白细胞介素-1受体(toll/IL-1 receptor,TIR)超家族重要的接头分子,在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用[1,2]。TRAFs包括7个密

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