淋病奈瑟菌外膜蛋白反向候选疫苗的初步实验筛选

发布时间：2017-08-14 19:38

  本文关键词：淋病奈瑟菌外膜蛋白反向候选疫苗的初步实验筛选

  更多相关文章： 淋病奈瑟菌 外膜蛋白 原核表达 包涵体纯化 免疫原性 免疫反应性 膜定位

【摘要】：目的从淋病奈瑟菌全基因组中已预测出的疫苗候选外膜蛋白中,选取两种外膜蛋白和一种非外膜蛋白,克隆并表达出重组蛋白,用重组蛋白来免疫小鼠,获取重组蛋白抗血清。对预测的外膜蛋白抗原进行细菌表面定位以及免疫原性和免疫反应性的初步实验研究,以探讨反向疫苗学结合实验方法筛选淋病奈瑟菌候选外膜蛋白疫苗的可行性,为淋病奈瑟菌疫苗的研究提供了新的思路。方法1候选外膜蛋白抗原基因的克隆和表达:前期研究已从淋病奈瑟菌全基因组数据库中预测和分析出了一系列外膜蛋白,从中随机选取两种外膜蛋白(YP_207398.1和YP_207701.1)和一种非外膜蛋白(YP_207727.1)基因,用Premier 5.0软件设计合成最佳引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌标准株(ATCC 49226)基因组中扩增出三个目的基因片段,以p GEX4T-1为载体分别构建三种基因的重组质粒,并在BL21宿主菌中分别诱导重组蛋白的表达,优化重组蛋白的表达条件,用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达情况。2重组蛋白的纯化:细菌经超声破碎后,获取菌体沉淀,分别用Triton X-100和尿素来洗涤包涵体,再对包涵体进行溶解、复性和纯化以获取目的蛋白,同时采用切胶纯化的方法来获取目的蛋白。3重组外膜蛋白免疫反应性和免疫原性及其在细菌膜表面定位的初步研究:(1)用乙醇灭活法制备的淋病奈瑟菌标准株(ATCC 49226)全细胞抗原并免疫家兔,获取免疫血清,以免疫血清为一抗,用Western Blot技术检测重组蛋白的免疫反应性。(2)重组蛋白抗血清的制备:将每种重组蛋白以50μg的剂量与弗氏佐剂混合后免疫接种BALB/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。末次免疫后1周,收获免疫血清。(3)外膜蛋白抗原在细菌表面的定位:用淋病奈瑟菌标准株(ATCC 49226)制备的全细胞抗原包被96孔板,以小鼠免疫血清作为一抗,酶标记的羊抗鼠Ig G作为二抗,检测血清抗体滴度,以评价重组蛋白的免疫原性及其抗体与菌体表面蛋白的结合能力,从而初步判定预测的候选外膜蛋白的免疫原性及其是否位于淋病奈瑟菌表面。结果1构建了淋病奈瑟菌标准株三个候选外膜蛋白基因的原核表达重组质粒PGEX4T-1-YP_207398.1;PGEX4T-1-YP_207701.1;PGEX4T-1-YP_207727.1;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导后,三个重组蛋白菌均以包涵体形式表达,最佳表达条件分别是:YP_207398.1蛋白:37℃,2.0mmol/L IPTG诱导5h;YP_207701.1蛋白:37℃,2.0mmol/L IPTG诱导1h;YP_207727.1蛋白:37℃,0.5mmol/L IPTG诱导4h。2 Western Blot分析显示:候选外膜蛋白抗原能够被抗淋病奈瑟菌多克隆抗体识别。3成功获得纯化蛋白,用Triton X-100和尿素来洗涤包涵体后,再用包涵体溶解液溶解已洗涤的包涵体,结果发现三个重组蛋白均不能充分溶解。而采用切胶、电洗脱和透析的方法可获得重组蛋白的粗提物。4成功获得三个重组蛋白的抗血清,通过间接ELISA检测发现:淋病奈瑟菌全细胞抗原免疫组、YP_207701.1蛋白免疫组和YP_207398.1蛋白免疫组产生的免疫血清抗体均能够和淋病奈瑟菌全细胞抗原发生特异性结合,其中YP_207701.1蛋白免疫组的血清效价高于YP_207398.1蛋白免疫组;而YP_207727.1蛋白免疫组的免疫血清抗体未能与淋病奈瑟菌全细胞抗原发生明显结合。结论1成功构建了PGEX4T-1-YP_207398.1;PGEX4T-1-YP_207701.1、PGEX4T-1-YP_207727.1三个原核表达载体,并在大肠杆菌BL21内得到了表达,为本研究及后续的淋病奈瑟菌疫苗的研究奠定了基础;2通过对重组蛋白抗血清与淋病奈瑟菌全细胞抗原的间接ELISA反应,发现经反向疫苗学预测为外膜蛋白的两个重组蛋白(YP_207701.1和YP_207398.1)抗血清都能与淋病奈瑟菌全细胞抗原反应,重组蛋白YP_207701.1免疫组抗血清的抗体效价显著高于YP_207398.1免疫组,而预测为非外膜蛋白的重组蛋白(YP_207727.1)抗血清不能与淋病奈瑟菌全细胞抗原反应,初步表明两个重组蛋白位于淋病奈瑟菌的细胞表面,具有较好的免疫原性和免疫反应性。3本研究为反向疫苗学预测出的候选外膜蛋白的实验筛选提供了实验数据和方法,也为淋病奈瑟菌反向候选疫苗的研究提供了一个新的思路。
【关键词】：淋病奈瑟菌 外膜蛋白 原核表达 包涵体纯化 免疫原性 免疫反应性 膜定位
【学位授予单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-14
• 材料14-21
• 技术路线21-22
• 第一部分 反向外膜蛋白候选抗原基因的克隆和表达22-42
• 1 引言22-23
• 2 方法23-32
• 3 结果32-40
• 4 讨论40-41
• 5 小结41-42
• 第二部分 候选重组外膜蛋白的纯化及其免疫原性和表达定位的初步研究42-51
• 1 引言42-43
• 2 方法43-46
• 3 结果46-48
• 4 讨论48-50
• 5 小结50-51
• 总结51-52
• 参考文献52-55
• 附录55-64
• 文献综述64-73
• 参考文献71-73
• 致谢73

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本文编号：674397