泛素和转铁蛋白受体表达载体的构建、表达和鉴定

发布时间：2017-08-21 08:10

  本文关键词：泛素和转铁蛋白受体表达载体的构建、表达和鉴定

  更多相关文章： 泛素 转铁蛋白受体 内吞 胞内体分选

【摘要】：胞内体蛋白分选是泛素调控内吞作用中的关键步骤,不仅参与养分,代谢物,激素和生长因子的摄取,分选及处理;维持极性上皮细胞细胞质膜功能域的分布特点;受体和配体的再循环等多种过程,而且对于维持细胞的许多重要生理功能(如细胞周期的调控、抗原递呈、信号转导等)有着极其重要的作用。目前发现的许多遗传性和获得性疾病(如肿瘤、囊性纤维化)的发生都与此途径功能失调相关。它也参与了机体抑制肿瘤、神经变性性疾病以及感染性疾病等病理过程,这说明其在细胞内具有非常重要的功能。胞内体蛋白分选转运复合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)能将被泛素标记的蛋白分选入溶酶体途径进行降解。ESCRT也在胞质分裂和病毒出芽过程中发挥重要作用。泛素-转铁蛋白受体(Ubiquitin-Transferrin receptor,Ub-Tf R)嵌合蛋白由于有泛素标记转铁蛋白受体,使其在胞内体上被分选进入多泡体/溶酶体的降解途径,而不是沿着转铁蛋白受体通过再循环内体回到细胞质膜的经典途径,是研究胞内体蛋白分选途径共同机制的理想标记之一。所以我们通过构建泛素和转铁蛋白受体表达质粒的构建,为下一步的研究胞内体分选相关蛋白奠定基础。方法:1.构建泛素表达载体采用PCR扩增小鼠泛素基因,经过双酶切,将泛素基因克隆于表达载体p CI-neo-HA中,测序正确后提取质粒。2.泛素载体的表达测序正确的泛素表达质粒转染Hela细胞,裂解细胞,收集细胞裂解液。通过Western blot检测泛素蛋白的表达。3.构建转铁蛋白受体表达载体采用PCR扩增人转铁蛋白受体基因,经过双酶切,将转铁蛋白受体基因克隆于表达载体p CI-neo-HA中,测序正确后提取质粒。4.转铁蛋白受体载体的表达及鉴定测序正确的转铁蛋白受体表达重组质粒转染Hela细胞,裂解细胞,收集细胞裂解液。通过Western blot、免疫荧光等检测转铁蛋白受体的表达。结果:1.泛素蛋白载体的构建、表达及鉴定通过设计特异性引物,经PCR扩增得到泛素基因片段约285bp,与预期相符;将扩增产物纯化与载体质粒p Cl-neo-HA酶切后连接,送公司测序。测序正确后,转染Hela细胞,转染后裂解细胞,离心获得细胞裂解液。Western Blot鉴定蛋白分子量为10KDa,表明为目的蛋白。2.人转铁蛋白受体表达系统构建、表达及鉴定通过设计特异性引物,经PCR扩增得到转铁蛋白受体基因片段约2309bp,与预期相符;将扩增产物纯化与载体质粒p Cl-neo-HA酶切后连接,送公司测序。测序正确后,转染Hela细胞,转染后裂解细胞,离心获得细胞裂解液。Western Blot鉴定蛋白分子量为90KDa,表明为目的蛋白。免疫荧光证实了转铁蛋白内吞后被分选循环回细胞膜的内吞途径。结论:1.成功构建了p Cl-neo-Ub表达质粒,质粒转染Hela细胞后表达的泛素蛋白明显增高。2.成功构建了p Cl-neo-Tf R表达质粒,质粒转染Hela细胞后表达的转铁蛋白受体蛋白明显增高,并证实了转铁蛋白内吞后的循环途径,为下一步构建泛素-转铁蛋白受体嵌合蛋白和进一步研究胞内体分选相关蛋白奠定了基础。
【关键词】：泛素 转铁蛋白受体 内吞 胞内体分选
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-14
• 第一部分 泛素蛋白表达系统的构建、表达和鉴定14-28
• 1 材料与方法14-24
• 2 结果24-27
• 3 讨论27-28
• 第二部分 转铁蛋白受体表达系统的构建、表达和鉴定28-45
• 1 材料与方法28-38
• 2 结果38-44
• 3 讨论44-45
• 小结45-46
• 参考文献46-50
• 综述50-62
• 参考文献57-62
• 缩略词表62-63
• 在读期间发表的论文63-64
• 致谢64

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本文编号：711751