我国华支睾吸虫中间宿主螺类分子系统发育研究

发布时间：2017-08-24 07:07

  本文关键词：我国华支睾吸虫中间宿主螺类分子系统发育研究

  更多相关文章： 华支睾吸虫 中间宿主 螺 DNA条形码 系统发育 分类 鉴定 形态学

【摘要】：华支睾吸虫隶属于后睾科(Opisthorchiidae)的支睾属(Clonorchis),它寄生于人体肝胆系统,可引发多种疾病,如胆石症、胆囊炎、胆管炎、胆管癌等。它是一种严重危害人类健康的食源性寄生虫病。我国为华支睾吸虫的流行地区,华支睾吸虫病是我国重点防治的寄生虫病之一。华支睾吸虫的生活史复杂,需要两个中间宿主(螺和鱼虾)和一个终宿主才能完成整个生活史。华支睾吸虫生活史中较少有研究是针对于其第一中间宿主螺类。研究中间宿主螺类的分类,对防治华支睾吸虫病及螺类的生物学研究等具有实际意义。目前,一些中间宿主螺类有一些相近种类形态不易区分,结合外部形态及内部解剖等形态学方法鉴定物种有难度,而运用近几年新兴的分子生物学技术进行第一中间宿主螺类的分类研究却有实际意义。DNA条形码(DNA barcoding)是一种新兴的物种鉴定方法,即从DNA序列上选取一个较短的片段应用为快速鉴别种类的标记,不同物种的标记可与相应的物种建立相互对应的关系。这种分子生物学方法已广泛应用。在本研究中,我们首先验证了DNA条形码技术用于华支睾吸虫中间宿主种类鉴定的可行性,再利用该技术对中间宿主螺类进行了初步的系统发生关系的研究。此外,还对广西横县两种螺是否存在同种异名现象进行了探讨。具体研究结果如下：1.对采集于我国华支睾吸虫第一中间宿主螺类广泛分布地区的9种(另外有三个为未知种)共136个个体的线粒体COI基因进行PCR扩增与测序,共得到9种(另外还有三个未知种)85条COI序列,扩增个体的成功率为62.5%。对所得的COI序列分析后,发现豆螺科内所测物种的种内平均遗传距离为1.31%,其中最大的种内遗传距离为14.50%,最小种内遗传距离为0.2%。豆螺科内各个种间平均遗传距离为14.80%,存在条形码间隙。其他科的螺类,如跑螺科(Thiaridae)的瘤拟黑螺(Melanoides tuberculata)、肋蜷科(Pleuroseridae)的方格短沟蜷(Semisulcospira cancellata)和放逸短沟蜷(Semisulcospira libertind)及拟沼螺未知种(Assimineidae)的平均种内遗传距离小于1%,种间距离为平均种内距离的10倍以上,存在条形码间隙。结果证明,基于COI序列的DNA条形码技术可有效鉴定本研究中的螺类。2.在本研究中,将COI、16S rDNA、ITS-1、28S rDNA四个基因位点合并应用于本研究中螺类的系统发育分析。结果发现16S rDNA的通用引物难以扩增大部分实验样品,研究中较易扩增获得ITS-1和28S rDNA的DNA条形码序列。在基于COI序列构建的系统树中,几乎所有种类形成单系群,并有较高的支持度。其属和总科也形成了各自的分支。而基于16S rDNA、ITS-1、28S rDNA基因构建的系统树与传统形态学分析结果有较大出入。3.应用DNA条形码技术结合形态学、解剖学方法鉴别采集于广西横县的硬豆螺(Bithynia robusta)与赤豆螺(Bithynia fuchsiana)。两种豆螺形态相似、栖息生境相同,考虑可能存在同种异名现象。通过观察两种螺类的外部形态及测量其主要参数,比较两种豆螺的雄性生殖系统,采用基于COI(Cytochrome c oxidase subunit Ⅰ, COI)基因的DNA条形码方法进行螺种鉴别,并构建系统树。在研究中发现两种螺类的个体外形基本一致,并具有形态相似的雄性生殖系统。两种螺类的种间距离小,小于3%。COI基因序列的变异较小。序列进行整理和剪切后,22个个体的COI基因片段均为517bp,无插入、缺失位点。根据COI基因序列进行系统树的构建,发现两类群的个体明显聚为一支。根据本研究的形态学和COI基因序列证据,提示采自广西横县的赤豆螺与硬豆螺可能为同种异名。
【关键词】：华支睾吸虫 中间宿主 螺 DNA条形码 系统发育 分类 鉴定 形态学
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R383.22
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-21
• 1. DNA条形码技术12-16
• 1.1 DNA条形码方法概述12-13
• 1.1.1 DNA条形码的相关概念12
• 1.1.2 DNA条形码技术的操作流程12-13
• 1.1.3 DNA条形码方法的优缺点13
• 1.2 DNA条形码技术的应用13-15
• 1.2.1 DNA条形码在软体动物鉴定中的应用13-15
• 1.2.2 DNA条形码在医学贝类研究中的应用15
• 1.3 DNA条形码方法在贝类研究中的前景及展望15-16
• 2. 分子系统发育学16-18
• 2.1 系统发育学的发展16
• 2.2 基本概念16-17
• 2.3 一般研究方法17-18
• 3. 华支睾吸虫第一中间宿主概况18-19
• 3.1 中间宿主螺类概述18-19
• 3.1.1 豆螺科概述18-19
• 3.1.2 肋蜷科概述19
• 3.1.3 跑螺科概述19
• 3.1.4 拟沼螺科概述19
• 4. 本研究的立题依据、研究内容及目的19-21
• 第一部分 我国华支睾吸虫第一中间宿主螺类DNA条形码研究21-35
• 1. 引言21
• 2. 材料与方法21-25
• 2.1 样品采集21-22
• 2.2 形态学观察结果22-23
• 2.3 DNA条形码实验23-25
• 3. 实验结果25-32
• 3.1 形态鉴定结果25-27
• 3.2 DNA条形码COI扩增结果27
• 3.3 序列特征分析27-28
• 3.4 遗传距离与邻接树分析28-32
• 4. 讨论32-34
• 4.1 本研究中螺类形态的多样性32
• 4.2 COI基因引物有效性32-33
• 4.3 COI基因在螺类鉴定中的有效性分析33-34
• 5. 总结34-35
• 第二部分 我国华支睾吸虫第一中间宿主螺类系统发育研究35-48
• 1. 引言35-36
• 2. 材料与方法36-37
• 2.1 实验材料36
• 2.2 实验方法36
• 2.3 PCR扩增及测序36-37
• 3 结果37-45
• 3.1 COI序列37-38
• 3.2 16S rDNA序列38-40
• 3.3 ITS-1序列40-42
• 3.4 28S rDNA序列42-45
• 4. 讨论45-47
• 4.1 COI和16S rDNA基因用于分子系统学研究的有效性45-46
• 4.2 ITS-1基因应用于系统发育研究的有效性46
• 4.3 28S rDNA基因应用于系统发育研究的有效性46-47
• 5. 总结47-48
• 第三部分 应用形态学及DNA条形码技术鉴别广西横县地区两种豆螺48-58
• 1. 引言48
• 2. 材料与方法48-50
• 2.1 材料49
• 2.2 外部形态参数比较49
• 2.3 生殖系统解剖49
• 2.4 DNA提取及PCR扩增49
• 2.5 数据分析49-50
• 3. 实验结果50-56
• 3.1 贝壳形态50-51
• 3.2 生殖系统解剖结果51-52
• 3.3 DNA序列分析及遗传距离分析52-53
• 3.4 系统学分析53-56
• 4 讨论56-58
• 研究总结58-60
• 1. 主要研究结果58
• 2. 创新点58
• 3. 不足与展望58-60
• 参考文献60-63
• 致谢63-65
• 发表文章65-66
• 附录一66-70
• 附录二70-74

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本文编号：729875