应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒

发布时间：2017-08-30 22:18

  本文关键词：应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人GDF-5基因重组腺病毒

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【摘要】：目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统构建人生长分化因子-5(GDF-5)基因重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法将PCR获取的GDF-5基因插入到质粒pMD19-T中,基因测序鉴定后将目的基因克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,HindⅢ酶切鉴定。重组质粒经PmeⅠ酶切使之线性化并去磷酸化处理,电转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,卡那霉素筛选,HindⅢ酶切鉴定阳性克隆,扩增重组腺病毒质粒,并转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒Ad-GDF-5,分别采用Western blot、TCID50法对Ad-GDF-5进行蛋白鉴定和滴度测定。结果经PCR扩增得到的GDF-5大小约为1.7kb,基因测序结果证实该基因与GENBANK中人GDF-5基因序列相同。pShuttle-CMV-GDF-5、pShuttle-CMV-GDF-5-AdEasy-1经HindⅢ酶切后均得到大小约为1.7kb的片段,与GDF-5大小相符。Western blot证实Ad-GDF-5感染HEK293细胞后大量表达成熟GDF-5蛋白。研究结果表明成功地构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体,并制备出5.6×109 PFU/mL的重组腺病毒。结论利用AdEasy-1腺病毒载体系统成功构建了携带人GDF-5基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度值的重组腺病毒Ad-GDF-5,为进一步研究GDF-5的生物学功能及其相关疾病的基因治疗奠定了基础。
【作者单位】： 南充市中心医院;川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所;
【关键词】： 腺病毒科 生长分化因子- 基因治疗
【基金】：国家自然科学基金资助项目(81201407、81171472、81071270、30872614) 四川省杰出青年学科带头人资助计划(09ZQ026-005) 四川省科技支撑计划项目(2010SZ0048) 南充市应用技术研究与开发资金项目(11A0115) 川北医学院科研发展计划项目重点培育项目(CBY11-A-ZP01)
【分类号】：R346
【正文快照】： 生长分化因子-5(GDF-5)亦称软骨源性形态发生蛋白-1(CDMP-1)或骨形态发生蛋白-14(BMP-14),是转化生长因子-β(TGF-β)超家族-骨形态发生蛋白(BMPs)家族中的特殊成员,是骨骼正常发生和发育必需的生长因子。GDF-5除了可促进软骨发生、软骨成骨、长骨发育、关节形成和修复骨、软

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本文编号：761796