Hsa-microRNA-218与颗粒溶素表达关系的探讨

发布时间：2017-10-14 16:32

  本文关键词：Hsa-microRNA-218与颗粒溶素表达关系的探讨

  更多相关文章： 结核病 颗粒溶素 miR-218 qRT-PCR 流式细胞术

【摘要】：目的：将颗粒溶素(Granulysin, GLS)表达质粒与microRNA (miRNA)干扰质粒共转染入293T细胞中,在细胞层面上观察hsa-microRNA-218(miR-218)对GLS蛋白表达的干扰效果；应用Taqman探针、qRT-PCR检测miR-218在结核病(Tuberculosis, TB)人血清、血浆中的表达情况,为进一步探讨miR-218作为TB检测生物标志物在诊断结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染的应用方面提供方法和实验基础；运用流式细胞术(Flowcytometry, FCM)从外周血中筛选出CD4+T细胞、CD8+T细胞,用LV3-miR-218等包装慢病毒感染后,Western-blot探讨miR-218和GLS表达间的关系。方法：1.抽提佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetatefor, PMA)激活的THP-1细胞的总RNA,逆转录后PCR扩增GLS基因,将其克隆至pDsRed-Express-Cl,构建GLS表达质粒pDsRed-GLS。将pDsRed-GLS与pGenesil-miR-218 (pGenesil-miR-control)共转染293 T细胞,36 h后激光共聚焦显微镜观察两种质粒在细胞中的表达情况,48 h后提取细胞总RNA和蛋白,RT-PCR和Western Blot检测miR-218对GLS表达的影响。2.设计miR-218及内参U6snRNA特异性逆转录引物及Taqman探针,抽提TB患者和健康人群对照组血清、血浆标本中的总RNA,逆转录反应后,运用qRT-PCR检测miR-218的表达情况。同时比较miRNA专用提取试剂盒和TRIzol试剂在TB血清、血浆中抽提miR-218的效率；miR-218在TB血清和血浆中的含量；血清标本经预热处理和10%SDS溶液预处理对抽提miR-218的影响。3.运用FCM从TB患者和健康人群的外周血中分选出CD4+T细胞、CD8+T细胞,比较两种细胞的比例和比值变化；qRT-PCR检测miR-218在外周血CD4-T细胞、CD8+T细胞中的表达情况；慢病毒LV3-miR-218/LV3-miR-control、LV10-miR-218 inhibitor/ LV10-miR-control inhibitor感染CD4+T细胞、CD8+T细胞后,Western-blot探讨miR-218和GLS表达间的关系。结果：1.酶切和测序结果证实重组质粒pDsRed-GLS构建成功,且能与miRNA干扰质粒在293 T细胞中共表达。与转染pGenesil-miR-control组细胞相比,Western-Blot结果显示转染pGenesil-miR-218组细胞的GLS蛋白表达下降约50%(P0.05),而GLS mRNA表达则无明显变化(P0.05)。2.MiR-218在血清、血浆中都是稳定存在的,可以被检测出；miR-218在TB患者体内的表达量是显著升高的(P0.05),相较于血清,它在血浆中的含量更为丰富(P＜0.05); miRNA专用提取试剂盒提取miR-218的效率高于TRIzol试剂(P0.05)；对TB患者血清标本进行预热或10%SDS溶液预处理后都能很好地提高抽提miR-218的效率,降低qRT-PCR检测时的CT值(P0.05),两种处理方法相比较,并无明显差异(P0.05)。3.相较于健康人群,TB患者外周血中CD4+T细胞的比例降低(P0.05),CD8+T细胞的比例增高(P0.05),CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值下降(P0.05):miR.218在TB患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞中的表达同健康人群对照组相比,没有显著的统计学意义(P0.05)。结论：1.MiR-218在转录后水平干扰了GLS的表达。2.MiR-218在TB患者体内表达量显著升高；Taqman探针结qRT-PCR技术适用于检测TB血清、血浆中miR-218的表达,血浆作为检测标本更佳；miRNA专用提取试剂盒、对标本进行预热或1 0%SDS溶液预处理都能很好提高提取血清、血浆中miR-218的效率。3.同正常人群相比,TB患者外周血中CD4+T细胞的比例降低,CD8’T细胞的比例增高,CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值降低；miR-218在TB患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞中的表达同健康人群对照组相比,没有显著统计学意义。
【关键词】：结核病 颗粒溶素 miR-218 qRT-PCR 流式细胞术
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R51
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 细胞水平探讨miR-218与颗粒溶素表达关系17-33
• 1 材料和方法17-27
• 2 结果27-31
• 3 讨论31-32
• 4 小结32-33
• 第二部分 MiR-218在结核病血清、血浆中的检测应用33-41
• 1 材料和方法33-36
• 2 结果36-39
• 3 讨论39-40
• 4 小结40-41
• 第三部分 临床水平探讨miR-218与颗粒溶素表达关系41-50
• 1 材料和方法41-45
• 2 结果45-48
• 3 讨论48-49
• 4 小结49-50
• 全文小结50-51
• 参考文献51-55
• 文献综述55-68
• 参考文献62-68
• 致谢68-69
• 攻读硕士期间发表学位论文69

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本文编号：1032091