一步反转录PCR技术在检测4种人疟原虫中的初步应用

发布时间：2017-10-17 12:40

  本文关键词：一步反转录PCR技术在检测4种人疟原虫中的初步应用

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【摘要】：目的探讨应用一步反转录PCR(RT-PCR)技术检测4种人疟原虫的可行性和特异性。方法取恶性疟(1例)、间日疟(1例)、卵形疟(1例)和三日疟(5例)患者全血,提取疟原虫总RNA和基因组DNA。应用一步RT-PCR和一步实时荧光RT-PCR分别扩增经脱氧核糖核酸酶(DNase)消化的疟原虫RNA样品中的18S rRNA序列,应用普通PCR和一步RT-PCR技术分别扩增不同稀释浓度的疟原虫RNA(未经DNase消化和经DNase消化)和DNA样品中的疟原虫18S rRNA序列和18S r DNA序列,比较2种检测技术可检测到目标序列的样品最低稀释浓度。结果患者全血基因组DNA经一步RT-PCR分别扩增出310、394和323 bp条带,测序结果显示分别为恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)的18S rRNA序列特异性条带,但未扩增出三日疟原虫(P.malariare)特异条带。一步实时荧光RT-PCR结果显示,4种人疟原虫RNA样品均出现相应的荧光信号,除三日疟原虫样品外,各溶解曲线均仅有单一的扩增峰。因4种人疟原虫DNA和RNA原液样品中模板量的差异,一步RT-PCR可检测到的最低稀释浓度从1至10-4不等,但可检测到的DNA样品的最低稀释浓度与未经DNase消化的RNA样品相同或较后者低一个数量级,且两者最低稀释浓度均低于经DNase消化的RNA样品。与普通PCR的检测结果比较发现,同一样品均以一步RT-PCR可检测到的稀释浓度最低,较普通PCR的敏感性提高10~1 000倍。结论一步RT-PCR技术可检测出人血液样品中的恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫DNA,但在检测三日疟原虫样品中的适用性有待进一步分析。
【作者单位】： 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 世界卫生组织热带病合作中心 科技部国家级热带病国际联合中心 卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室;上海市疾病预防控制中心;安徽省疾病预防控制中心;
【关键词】： 反转录PCR 疟原虫 核糖体小亚基
【基金】：寄生虫病预防控制所防治技术储备科研基金(No.CB-15006)~~
【分类号】：R531.3
【正文快照】： 随着疟疾发病率的持续下降,分子技术因其在检测疟原虫中的重要作用被逐渐推广并应用于低疟区或无疟区疟疾检测[1]。该法大多基于疟原虫属(Plasmodium)及属内不同种类原虫的小核糖体亚基基因(SSU r RNA或18S r RNA)保守区和种特异区序列而设计[2]。但同一种疟原虫基因组中含有

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本文编号：1048934