尚未传入我国重要虫媒病毒快速检测方法的建立

发布时间：2017-10-20 23:21

  本文关键词：尚未传入我国重要虫媒病毒快速检测方法的建立

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【摘要】：虫媒病毒(arbovirus)是指通过吸血节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而引起的自然疫源性疾病及人兽共患病的一组病毒。主要集中在披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)、黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flavivirus)和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)及呼肠孤病毒科(Reoviridae),如披膜病毒科甲病毒属的巴马哈森林病毒(Barmah Forest virus,BFV)、基孔肯尼亚病毒(Chikungunya virus,CHIKV)、东方马脑炎病毒(Eastern equine encephal omyelitis virus,EEEV)、西方马脑炎病毒(Western equine encephal omyelitis virus,WEEV)、罗斯河病毒(Ross river virus,RRV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venzuelan Equine Encephal omyelitis virus,VEEV);黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flaviviru)的黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)、昆津病毒(Kunjin virus,KUNV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)、西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒;布尼亚病毒科的拉克罗斯病毒(La Crosse virus,LACV)、雪靴野兔病毒(Snowshoe hare virus,SSH)、加利福尼亚脑炎血清组病毒(california encephalitis virus),塔希纳病毒(Tahyna virus,TAHV)。昆虫通过叮咬将病毒传播给人、畜并引起疾病,不但会造成人类疾病和死亡,更易造成大批牲畜发病甚至死亡,带来巨大的经济损失,已成为世界各国的公共卫生问题。目前我国尚未分离到KUNV和BFV,但是存在有相关媒介蚊虫,且具备WNV流行的生态学条件,KUNV作为WNV的一个亚种传入中国的风险很大。目前也尚无YFV流行或确诊的报道,但由于我国部分地区的地理、气候、传播媒介-蚊、传染源-猴等条件与非洲、中、南美洲相似,并且随着全球经济的发展,全球贸易一体化和都市化生活等趋势,每年约有300万以上旅行者出入YFV流行区,这使得病毒和传播媒介更易在各个国家之间传播。虫媒病毒为全世界分布,但主要分布在中温带、亚热带及热带。大多数的虫媒病毒只分布于一个地区或是一个洲,但是可随着人群的流动、宿主和媒介的迁移而传播至异地。因此我们应加强入境医学媒介携带虫媒病毒的监测和检测。目前,虫媒病毒的检测主要有病毒分离法、血清学及分子生物学方法,但是这几种方法都有各自的不足之处。病毒分离法虽是金标准,但因其技术难度比较大,周期长,在实际工作中难以得到推广和应用。血清学的酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent,elisa)检测法,目前能用于虫媒病毒检测的商品化试剂数量较少,对于尚未传入我国的虫媒病毒则没有相应的全病毒抗体用于病毒抗原检测,并且elisa用于抗体检测的一个致命缺陷是由于同一病毒属内的病毒抗原性相似,影响结果的准确性,因而限制了其广泛应用。近年来随着pcr技术的推广应用,实时荧光pcr及常规反转录pcr扩增(rt-pcr)在蚊媒体内病毒的检测方面被广泛应用。rt-pcr方法快速、敏感,能在5-8小时内检测到病毒,适合于口岸要求。本研究利用双重rt-pcr及实时荧光rt-pcr技术,建立快速、敏感、高特异性的检测虫媒病毒的方法,应用于国境口岸虫媒病毒的监测及检测。目的:本研究拟开展尚未传入我国的重要虫媒病毒,尤其是入境医学媒介携带虫媒病毒的快速检测技术研究,建立同时能检测kunv和bfv的双重rt-pcr方法和分别建立kunv、yfv及bfv荧光rt-pcr检测方法,并应用于国境口岸蚊虫媒介携带虫媒病毒的检测。方法:从genbank中检索34株kunv,26株bfv,30株yfv全基因序列,通过dnastar软件进行序列比对和blast进行保守序列搜索和分析,选择kunv和bfv高度保守的e基因、yfv保守基因e基因为目的基因,用primer5.0和beacondesigner7.0软件设计引物和探针。kunv和bfv的e基因序列委托上海英潍捷基贸易有限公司合成,再按照体外转录试剂盒操作说明提取kunv和bfv的rna,再反转录成cdna。用qiagen的rna提取试剂盒提取yfv的rna,建立kunv和bfv双重rt-pcr检测方法,分别建立kunv、bfv及yfv荧光rt-pcr检测方法。结果:①建立了KUNV和BFV双重RT-PCR方法,敏感性为KUNV:1.83×106copies/μL,BFV:2.02×106copies/μL,与LACV、SSH、MAYV、YFV、JEV均无交叉反应。②建立了KUNV荧光RT-PCR方法,具有很好的特异性和灵敏性,敏感性为1.83×102copies/μL,与LACV、SSH、BFV、YFV、MAYV、JEV、和版纳病毒(Banna virus,BAV)均无交叉反应。③建立了BFV荧光RT-PCR方法,具有很好的灵敏性和特异性,敏感性为2.02×103copies/μL,与LACV、SSH、KUNV、MAYV、JEV、BAV、YFV均无交叉反应。④建立了YFV荧光RT-PCR方法,具有很好的灵敏性和特异性,敏感性为1.4×103copies/μL,与LACV、SSH、KUNV、BFV、MAYV均无交叉反应。结论:建立了KUNV和BFV双重RT-PCR方法、KUNV、BFV及YFV荧光RT-PCR方法,对于口岸蚊传虫媒病毒检测具有广泛的应用价值。
【关键词】：昆津病毒 黄热病毒 巴马哈森林病毒 荧光RT-PCR 双重RT-PCR
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R51;R446
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-17
• 材料与方法17-24
• 结果24-28
• 附图28-35
• 附表35-37
• 讨论37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-45
• 综述45-53
• 参考文献50-53
• 致谢53-54
• 个人简历54

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本文编号：1069969