2型猪链球菌组氨酸三聚体家族蛋白HtpsC与宿主细胞外基质作用机理的研究

发布时间：2017-10-21 05:10

  本文关键词：2型猪链球菌组氨酸三聚体家族蛋白HtpsC与宿主细胞外基质作用机理的研究

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【摘要】：猪链球菌(Streptococcus suis, S.suis)是一种重要的革兰氏阳性致病菌,可致人兽共患病。到目前为止,有35个血清型被临床检出,其中2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, S.suis 2)临床检出率最高且毒力最强。近年来, S.suis2感染在世界许多国家盛行,尤其是1998年和2005年中国的2次大规模感染人事件的爆发,导致国内外罕见的链球菌中毒样休克综合症(streptococcal toxic shock-like syndrome, STSLS),不仅造成巨大的经济损失而且造成严重的公共卫生事件。因此,开展对S.suis 2感染机理的研究,对于预防和控制S.suis 2的致病性具有重要的意义。但是,目前关于S.suis 2感染、入侵宿主的机理尚不清楚。因此,进一步研究2型猪链球菌毒力因子与宿主相互作用的机理,对于了解和明确S.suis 2致病性具有重大意义。组氨酸三聚体家族蛋白(Histidine traid proteins, Htp)是一类新发现的链球菌表面蛋白家族,因其含有高度保守的、多次重复的组氨酸三聚体基序(His-x-x-His-x-His)而得名。目前所有发现的Htp蛋白都是由链球菌的致病性基因编码。基于系统发育关系及结构组成,Htp蛋白可分为两个亚家族：HTP Ⅰ和HTP Ⅱ.其中,2型猪链球菌S.suis 2的HtpsC及其同源物即化脓链球菌S.pyogenes的S1r和无乳链球菌S.agalactiae的B1r,均属于HTP Ⅱ家族。它们的氨基酸序列具有典型的特征,即在其N端具有高度保守的、多次重复的组氨酸三聚体基序(His-x-x-His-x-His);在其C端具有高度保守、多次重复的亮氨酸重复序列LRRs结构域。研究表明,Sir和Blr均属于李斯特产单核细胞内化素A相关的链球菌LRR蛋白家族,其中Sir已经被证实能够与宿主细胞外基质ECM中的I型胶原相互作用,提示HTP Ⅱ家族蛋白能够与宿主细胞外基质作用进而发挥其致病性。在课题组前期的研究中,已经证实htpsC基因是S.suis 2中重要的毒力因子,涉及S.suis 2的致病性、粘附。通常,细菌粘附、入侵宿主是通过细菌表面粘附素(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules, MSCRAMMs)与宿主细胞外基质ECM之间的相互作用来完成的,病原菌与宿主ECM组分相互作用是细菌粘附、入侵宿主所普遍采取的机制。但是,迄今为止,还没有关于S.suis 2中HtpsC与宿主细胞外基质ECM作用机制的研究和报道。本研究通过对S.suis 2中国强毒株05ZYH33的htpsC基因序列分析,发现它含有2个高度保守的结构域,即N端HTP结构域和C端LRR结构域。通过基因克隆、原核表达及纯化获得了重组HtpsC蛋白。通过与宿主细胞外基质ECM组分的相互作用,证实HtpsC是S.suis 2表面的一个粘附素,且是一个纤连蛋白和层粘连蛋白结合蛋白,其功能是在S.suis 2感染宿主的过程中通过与宿主ECM纤连蛋白和层粘连蛋白的相互作用,从而介导细菌粘附宿主。本研究进一步地通过原核表达、纯化获得了rHTP和rLRR结构域蛋白,并证实S.suis 2中HtpsC的N端HTP结构域是一个层粘连蛋白结合结构域,而其C端LRR结构域是一个纤连蛋白结合结构域,分别介导HtpsC在S.suis 2感染宿主时与宿主细胞外基质层粘连蛋白和纤连蛋白的结合。菌体与宿主ECM的实验表明,相比于野毒株,△htpsC对纤连蛋白的结合下降了40%,对层粘连蛋白的结合下降了30%。综上所述,本研究鉴定了在S.suis 2感染宿主时,组氨酸三聚体家族蛋白HtpsC是S.suis 2表面的一个全新粘附素且是一个纤连蛋白和层粘连蛋白结合蛋白,在细菌感染、入侵宿主时通过与宿主细胞外基质ECM相互作用,主要粘附宿主细胞外基质纤连蛋白和层粘连蛋白,从而介导细菌粘附宿主。进一步地研究证明,其C端LRR结构域是一个纤连蛋白结合结构域,而其N端HTP结构域是一个层粘连蛋白结合结构域。研究结果表明,在S.suis 2感染宿主的过程中,其C端LRR结构域和N端HTP结构域分别介导HtpsC与宿主细胞外基质纤连蛋白和层粘连蛋白的结合,从而发挥其功能。
【关键词】：2型猪链球菌 HtpsC HTP结构域 LRR结构域 宿主细胞外基质
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R515
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 中英文缩写一览表7-12
• 第1章 绪论12-18
• 第2章 2型猪链球菌htpsC与宿主细胞外基质作用的研究18-32
• 2.1 实验材料和试剂18-21
• 2.1.1 实验菌株、质粒和培养基19
• 2.1.2 主要试剂和仪器19-21
• 2.2 实验方法21-24
• 2.2.1 S.suis 2 05ZYH33基因组htpsC基因序列分析21
• 2.2.2 htpsC基因的克隆和表达21-22
• 2.2.3 重组蛋白HtpsC的纯化22
• 2.2.4 兔抗HtpsC多克隆抗体的制备22
• 2.2.5 Western blot分析兔抗HtpsC多克隆抗体22-23
• 2.2.6 重组HtpsC蛋白与宿主细胞外基质的相互作用23
• 2.2.7 菌体粘附宿主细胞外基质ECM的鉴定23-24
• 2.2.8 统计学分析24
• 2.3 结果24-31
• 2.3.1 S.suis 2 05ZYH33基因组htpsC序列分析24-25
• 2.3.2 获得高纯度的重组蛋白HtpsC25-26
• 2.3.3 获得高效价的兔抗HtpsC多克隆抗体26
• 2.3.4 Western blot鉴定HtpsC与兔抗HtpsC多克隆抗体的反应26-27
• 2.3.5 HtpsC是S.suis 2的一个表面粘附素,属于微生物MSCRAMMs家族27-28
• 2.3.6 HtpsC是一个纤连蛋白和层粘连蛋白结合蛋白28-29
• 2.3.7 htpsC能够介导S.suis 2粘附宿主纤连蛋白和层粘连蛋白29-31
• 2.4 讨论31-32
• 第3章 HtpsC蛋白C端LRR结构域功能的研究32-44
• 3.1 实验材料和试剂32-33
• 3.1.1 实验菌株、质粒和培养基32
• 3.1.2 主要试剂和仪器32-33
• 3.2 实验方法33-37
• 3.2.1 S.suis 2 htpsC基因C端LRR结构域(lrr)片段的引物设计33
• 3.2.2 lrr片段的PCR克隆33
• 3.2.3 lrr片段的T克隆33-34
• 3.2.4 重组表达载体pET28a-lrr的构建与鉴定34
• 3.2.5 重组结构域蛋白rLRR的诱导表达与纯化34-35
• 3.2.6 兔抗rLRR多克隆抗体的制备35-36
• 3.2.7 Western blot分析兔抗rLRR多克隆抗体36
• 3.2.8 rLRR蛋白与宿主细胞外基质的相互作用36-37
• 3.2.9 统计学分析37
• 3.3 结果37-42
• 3.3.1 S.suis 2 htpsC基因C端lrr的编码区设计特异性引物37
• 3.3.2 构建pET28a-lrr重组表达载体37-38
• 3.3.3 获得高纯度的重组结构域蛋白rLRR38-40
• 3.3.4 获得高效价的兔抗rLRR多克隆抗体40
• 3.3.5 rLRR重组蛋白与兔抗rLRR多克隆抗体的反应40-41
• 3.3.6 LRR结构域能够介导HtpsC与宿主细胞外基质ECM结合41
• 3.3.7 LRR结构域主要结合纤连蛋白41-42
• 3.4 讨论42-44
• 第4章 HtpsC蛋白N端组氨酸三聚体结构域功能的研究44-55
• 4.1 材料和试剂44
• 4.2 实验方法44-48
• 4.2.1 S.suis 2 htpsC基因N端HTP结构域(htp)片段的引物设计44
• 4.2.2 htp片段的PCR克隆44-45
• 4.2.3 htp片段的T克隆45
• 4.2.4 重组表达载体pET28a-htp的构建与鉴定45-46
• 4.2.5 重组结构域蛋白rHTP的诱导表达与纯化46-47
• 4.2.6 兔抗rHTP多克隆抗体的制备47
• 4.2.7 Western blot分析兔抗rHTP多克隆抗体47
• 4.2.8 重组rHTP蛋白与宿主细胞外基质的相互作用47-48
• 4.2.9 统计学分析48
• 4.3 结果48-53
• 4.3.1 S.suis2 htpsC基因N端htp的编码区设计特异性引物48
• 4.3.2 构建pET28a-htp重组表达载体48-49
• 4.3.3 获得高纯度的重组结构域蛋白rHTP49-51
• 4.3.4 获得高效价的兔抗rHTP多克隆抗体51
• 4.3.5 rHTP重组蛋白与兔抗rHTP多克隆抗体的反应51
• 4.3.6 rHTP能够介导HtpsC与宿主细胞外基质ECM结合51-52
• 4.3.7 rHTP结构域主要结合层粘连蛋白52-53
• 4.4 讨论53-55
• 第5章 结论55-57
• 参考文献57-65
• 硕士期间发表的学术论文65-66
• 致谢66

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本文编号：1071445